北京協(xié)和醫(yī)院等機(jī)構(gòu)3D打印肝臟！延長肝衰竭小鼠模型的存活時(shí)間

來源：BioArt生物藝術(shù)

臟移植是治療各種終末期肝病的唯一方法。然而供體肝臟的短缺一直是臨床上限制肝移植的最主要因素。近年來，3D生物打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展非常迅速，比如神經(jīng)外科，頜面外科等。該技術(shù)在肝臟移植領(lǐng)域也頻有捷報(bào)傳來。最早在2013年，科學(xué)家首次報(bào)道了利用3D打印技術(shù)將3例捐獻(xiàn)者及患者的肝臟制成3D模型，用以指導(dǎo)接下來的移植策略。同年，有公司成功打印出深500 μm的肝臟組織，能正常存活40天，并且在體外具有普通肝臟的功能，后續(xù)該公司也打印出了具有生物活性的完整的迷你肝臟。但3D打印的肝臟組織能否在體內(nèi)發(fā)揮功能尚不清楚。2015年，北京協(xié)和醫(yī)院毛一雷教授成功在該領(lǐng)域取得突破并在當(dāng)年舉行的十五屆全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議作了報(bào)告，其研究團(tuán)隊(duì)成功在3D打印細(xì)胞結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)了膽管網(wǎng)廣泛分布，提高了三維結(jié)構(gòu)的物質(zhì)交換能力，最終得到了體外能長期存活的具有藥物代謝功能的人體類肝組織。

近日，來自北京協(xié)和醫(yī)院的毛一雷教授、清華大學(xué)孫偉教授以及上�？萍即髮W(xué)黃鵬羽教授的研究團(tuán)隊(duì)在GUT雜志在線發(fā)表了題為Three-dimensional bioprinted hepatorganoids prolong survival of mice with liver failure的文章，該研究以肝細(xì)胞和生物墨水為原料，采用特定的3D打印程序，打印出了肝臟類器官（3D bioprinted hepatorganoid，3DP-HO）。該3D打印類肝器官不僅在體外具有良好的肝臟特征，將其移植到I型酪氨酸血癥肝衰竭模型小鼠體內(nèi)，也能顯著改善小鼠的肝功能，并提高小鼠的存活率。這不僅為開發(fā)針對肝臟疾病的新型療法提供了新的工具，更展示了3D生物打印類器官的體內(nèi)活性和該技術(shù)在肝臟移植領(lǐng)域的應(yīng)用潛能。

作者首先探索了用于打印肝臟類器官的原料以及誘導(dǎo)分化的條件。作者在前期實(shí)驗(yàn)中對比了原代肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞以及多種肝細(xì)胞系。但原代肝細(xì)胞在3D打印過程中死亡率過高，而胎肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞（一種肝癌細(xì)胞系）的肝臟功能較差。綜合考慮對3D打印的耐受性和肝功能之后，作者采用了HepaRG細(xì)胞（一種人肝祖細(xì)胞）進(jìn)行后續(xù)的3D生物打印。生物墨水（用于粘合細(xì)胞的生物材料）的選擇在3D生物打印過程中也非常關(guān)鍵。明膠和藻酸鹽在用氯化鈣處理后具有良好的生物屬性，可以用作生物墨水。研究人員系統(tǒng)測試了不同比例的明膠和藻酸鹽，最終選擇了5％明膠和1％海藻酸鹽用作生物墨水組合。此外，溫度也是影響3D生物打印成功率的關(guān)鍵因素。研究人員經(jīng)對比測試后，采用在噴嘴中保持20℃，在成形空間中保持10℃來打印3DP-HO。

為了促進(jìn)3DP-HO中HepaRG細(xì)胞向肝細(xì)胞分化和成熟，作者先將3DP-HO在體外培養(yǎng)3天，然后通過0.5％DMSO處理7天誘導(dǎo)肝向分化。結(jié)果表明3DP-HO中HepaRG細(xì)胞可以在體外分化為白蛋白陽性的肝細(xì)胞(82.5%±4.6%)。經(jīng)體外誘導(dǎo)肝向分化后的3DP-HO也表達(dá)了大量的肝臟特異性基因，并具有了積累肝糖原、轉(zhuǎn)運(yùn)吲哚綠和乙�；�的低密度脂蛋白的能力。非常重要的是，3DP-HO也具有良好的肝臟解毒功能。與2D培養(yǎng)的HepaRG細(xì)胞，以及傳統(tǒng)的3D培養(yǎng)的HepaRG細(xì)胞相比，3DP-HO無論在肝臟基因表達(dá)還是功能上都更具優(yōu)勢。這些結(jié)果表明3DP-HOs在體外誘導(dǎo)肝向分化后表達(dá)了肝臟基因，并獲得了一些關(guān)鍵的肝臟功能。

研究人員隨后將體外誘導(dǎo)肝向分化的3DP-HO移植到了免疫缺陷的I型酪氨酸血癥肝衰竭模型小鼠體內(nèi)，這也是這項(xiàng)研究的一個(gè)重要的亮點(diǎn)。在接受3DP-HO移植后第4周，小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、直接膽紅素、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和堿性磷酸酶水平顯著降低，說明3DP-HO移植緩解了肝臟損傷。移植小鼠血清中酪氨酸等相關(guān)氨基酸水平也顯著下降，說明3DP-HO對I型酪氨酸血癥小鼠的酪氨酸代謝缺陷有明顯的治療效果。

在移植小鼠的血清中，研究人員也檢測到了大量人員的白蛋白、抗胰蛋白酶、凝血因子VII和凝血因子IX。尤其是，研究人員發(fā)現(xiàn)移植3DP-HO的小鼠獲得了人肝細(xì)胞特異的代謝異哇胍（debrisoquine）的能力。這說明3DP-HO確實(shí)在移植小鼠體內(nèi)發(fā)揮了肝臟的功能。此外，移植3DP-HOs也改善了小鼠原生肝臟的壞死現(xiàn)象。最重要的是，移植3DP-HO的肝衰竭小鼠存活時(shí)間顯著延長，并且移植后的3DP-HO中形成了新的血管網(wǎng)絡(luò)。

總而言之，研究人員使用了HepaRG肝祖細(xì)胞通過3D生物打印技術(shù)來構(gòu)建肝臟類器官。該類器官在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的肝臟功能，并且在移植后能夠延長肝衰竭小鼠的生存期。盡管這項(xiàng)研究距離臨床應(yīng)用還很遠(yuǎn)，但是這一開創(chuàng)性研究展示了3D生物打印技術(shù)在肝移植治療中的潛在價(jià)值。相信不遠(yuǎn)的將來，科學(xué)家可以利用生物3D打印技術(shù)打印出可供移植的人類肝臟，而這將造福萬千肝病患者。