生物3D打印路線圖重磅發(fā)布 （想了解它的現在與未來，看這一篇就夠了）

來源：上普生物

近期，生物3D打印領域一眾大咖們在本領域知名期刊Biofabrication上發(fā)表文章生物3D打印路線圖（The Bioprinting Roadmap），從生物3D打印的各個層面提出目前現狀、存在的問題與未來的可能路徑。無論您想全面了解生物3D打印，還是試圖探索本領域的新方向，看這一篇就夠了。

IOP官方下載量已破5000，當之無愧開年最火生物3D打印綜述。

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本文共11個小節(jié)，每一節(jié)由一位或多位行業(yè)資深學者撰寫。全文近萬字，滿滿干貨，閱讀時間大約需要20-30分鐘，可收藏慢讀，文末更有英文原文下載鏈接。

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為方便大家查閱，特在此列出簡要目錄，幫助大家定向閱讀。

1. 關于生物3D打印
2. 從細胞增殖到細胞打印
3. 生物墨水的開發(fā)
4. 干細胞的3D打印
5. 細胞團簇與類器官的大規(guī)模高效生產
6. 血管系統(tǒng)和組織構建的策略
7. 用于疾病研究的體外生物學模型
8. 器官芯片的開發(fā)
9. 多細胞工程生命系統(tǒng)
10. 太空上的生物3D打印
11. 生物3D打印工藝


關于生物3D打印
作者：Wei Sun
美國爵碩大學終身講席教授
Biofabrication主編
上普生物首席科學家

生物3D打印作為生物制造的核心技術，其運用細胞、蛋白質、生物材料等作為構造單元，以構建生物學模型、生命系統(tǒng)和治療產品。作者從構造單元層面上提出了生物3D打印的五個階段：

第一個階段是無生物相容性材料的打印，如樹脂、塑料等，主要用于外科手術設計模型或是牙科手術規(guī)劃；

第二個階段是打印具有生物相容性但不能降解的材料，如金屬，主要用于不可降解的假肢移植物；

第三個階段是打印具有生物相容性可降解的材料，如可降解的高分子材料，例如骨組織工程支架、人造皮膚修復體以及心臟支架等；

第四個階段是打印活性細胞，這類材料可以用來構建體外生物學模型、藥理/病理模型、器官芯片等；

第五個階段是打印類器官，如人工的生命系統(tǒng)、微型生理系統(tǒng)、細胞機器人等

生物3D打印的五個階段

作者指出，雖然生物3D打印在近幾年蓬勃發(fā)展，但是從技術層面仍然有幾大限制：

1. 生物墨水：我們仍需具有多功能性、對細胞友好的墨水用于生物打印

2. 打印工藝：我們需要更好的工藝和打印機，來制造高存活率和高精度兼顧的模型

3. 交聯技術：我們仍需更快、更強的交聯劑，來保證打印體完整性和穩(wěn)定性

4. 細胞培養(yǎng)：我們需要借助微流控技術來制造更長期的生理模擬系統(tǒng)

本文涉及生物3D打印領域各個分支研究方向，包括細胞增殖、生物墨水開發(fā)、干細胞打印、類器官生產、血管構建、體外模型、器官芯片、多細胞工程生命系統(tǒng)、太空生物打印與生物3D打印工藝。

生物3D打印隨著這幾年各領域人才的通力合作，已經在各個應用領域都有很有深度的發(fā)展和演變。這也是本篇文章的宗旨：旨在通過提供各領域權威專家分享的現狀和建議，為各位研究人員未來研究提出建設性意見。

從細胞增殖到細胞打印
作者：Binil Starly，Edward P Fitts：美國北卡羅萊納州立大學

生物3D打印目前的常規(guī)流程往往從細胞培養(yǎng)開始，所以細胞擴增成為了生物制造過程中極為關鍵的上游工藝�；�于生物反應器的細胞擴增方法有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法�，F有的生物反應器系統(tǒng)來自于疫苗或抗體的生產工藝，然而當活細胞作為反應器的最終產物時，該系統(tǒng)需要更精密的設計。

作者提出目前的細胞培養(yǎng)存在以下幾點問題：

1. 目前細胞培養(yǎng)普遍采用2D的培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，但是如果需要收獲數量可觀的細胞以實現用于治療用途的生物3D打印，2D的培養(yǎng)形式需要較大的空間，十分不方便。

2. 目前市場上的生物反應器缺乏實時跟蹤細胞分化時的狀態(tài)，細胞在反應器內處于“黑匣子”狀態(tài)，研究人員難以判斷。

3. 由于生物3D打印往往會應用病人自身的細胞，常規(guī)的細胞培養(yǎng)流程可能難以適用。

4. 在裝入生物3D打印機前的細胞操作是缺乏監(jiān)控的，容易造成細胞狀態(tài)的變化。

針對上述問題，作者提出以下技術路線的建議：

1. 細胞培養(yǎng)平臺與細胞增殖生物反應器相結合，以提升細胞產量和速度

2. 多種傳感器需要在反應器中應用，以確認細胞狀態(tài)、數量等

3. 需要建立數據模型以實現細胞狀態(tài)、形態(tài)等特征的共享

總得來說，隨著新技術的加持，下一代細胞培養(yǎng)需要更高效、更自動化、更智能。

生物墨水的開發(fā)
作者：AndrewC Daly，Jason A Burdick：美國賓夕法尼亞大學
Jürgen Groll：德國維爾茨堡大學

生物3D打印所使用的材料被稱為“生物墨水”，隨著行業(yè)的發(fā)展，生物墨水這個概念已經得到了極大了延伸。作者提出，生物3D打印實質上是將生物墨水由液態(tài)轉化為固態(tài)的過程，其流變性能以及生物相容性是成功打印的關鍵。

作者提出目前的生物墨水存在以下幾點問題：
1. 研發(fā)出具有可打印性的生物材料
2. 打印前后可以保持細胞活性
3. 可以提供適合細胞行為的細胞微環(huán)境

總的來說，如何平衡打印性、細胞活性和功能是生物墨水開發(fā)的一大難題，同時細胞增殖和結構穩(wěn)定性也是要考慮的要點。

微擠出式打印工藝是目前最常用的打印工藝，其通過擠出外力（氣動或電動）將材料通過噴嘴擠出成連續(xù)的絲材，并堆積成結構。例如GelMA這類光敏墨水在擠出后通過藍光或紫外光進行固化交聯；又如一些剪切變稀材料，可以在擠出過程中直接實現流變性能的轉化。

激光光刻式打印工藝（如SLA、DLP等）因其高精度而被廣泛使用，然而其打印大尺寸材料所需時間較長，所以如何保證細胞活性是一大難點。

1. 開發(fā)新型的復合生物3D打印工藝，針對墨水的不同交聯方式，復合打印工藝，實現分步交聯，達到打印目的。例如，通過透明針尖打印HAMA與GelMA的混合材料，進行原位打��；或是通過同軸噴頭打印海藻酸鈉類材料，以實現快速交聯。

2. 開發(fā)適用于現有打印工藝的新型墨水，如懸浮膠的設計可以用于打印低黏度材料如PVA；亦或是新型剪切變稀水凝膠的開發(fā)。

新型生物墨水全方位提高打印體的可能性

總之，墨水的開發(fā)與工藝息息相關，二者的研究同步進行才能取得突破性成果。未來的研究應著眼于生物墨水如何控制細胞行為，以主動協(xié)調細胞，快速實現功能性組織成熟。

干細胞的3D打印
作者：Gregor Skeldon, Wenmiao Shu：英國思克萊德大學

干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞、能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。干細胞的研究十分具有現實意義和潛力，所以研究者們開始嘗試生物打印干細胞。

作者提出目前的干細胞打印存在以下幾點問題：

1. 干細胞，特別是多功能干細胞非常脆弱敏感。由于打印過程的剪切應力較大，所以干細胞在打印過程中容易死亡，特別是高黏度的材料打印。

2. 生物墨水的配置對于干細胞來說至關重要，一方面干細胞需要足夠的營養(yǎng)和養(yǎng)分通道，需要生物墨水具有多孔空隙；另一方面要形成三維結構，需要生物墨水提供支撐，而空隙會降低其力學支撐性能。所以墨水的設計需要在這兩者中找到平衡。

3. 在三維環(huán)境下實現可控的干細胞分化是一大生物學難題，另外如何實現組織級細胞密度也是打印干細胞是需要解決的問題。

作者提出目前幾種技術可以幫助研究者克服上述難題：

1. 人體胚胎干細胞（hESCs）或人體誘導性多功能干細胞（hiPSCs）可以通過微閥噴射的方式打印或是激光誘導正向傳輸（LIFT）方法避免針頭的使用以降低剪切應力。

2. 有些研究者通過在墨水中添加粘附肽或是生物活性凝膠如Matrigel，羧甲基殼聚糖（CMC）等以增強干細胞的細胞存活率、功能性和強度。

3. 墨水中加入犧牲墨水如羧甲基殼聚糖（CMC）可以增強干細胞打印體中的孔隙率，方便營養(yǎng)物質的流通和干細胞的分化。

同時，作者提出，打印出干細胞離臨床、工業(yè)應用還有很遠的距離，干細胞的使用還會引發(fā)畸形瘤的潛在危險，所以產業(yè)化涉及規(guī)模、質量控制等方方面面。總的來說，由于干細胞的生物學功能還未徹底的研究投產，生物打印干細胞還有許多難題需要克服，不過隨著新的打印方法和材料的應用，相信這些難題可以迎刃而解。

細胞團簇與類器官的大規(guī)模高效生產
作者：Yasuyuki Sakai，Marie Shinohara，Masaki Nishikawa：日本東京大學

類器官（Organoids）由于其極好的生理學相似性，被應用在微組織的構建和研究中。然而，類器官的應用有諸多現實的問題。

類器官的生產往往是靜態(tài)培養(yǎng)，由分離的單細胞的在特定空間內重新聚集開始，這樣的方式可以輕松控制高均勻性的類器官尺寸，但這一方法不適合大規(guī)模生產。從規(guī)模化角度來看，團簇懸浮生物反應器是比較適合的方法。然而使用這種懸浮培養(yǎng)，控制、誘導和保存類器官要比靜態(tài)培養(yǎng)困難得多，所以如何能將可靠性和生產規(guī)模結合起來，是一個難題。

靜態(tài)培養(yǎng)（a）與懸浮培養(yǎng)（b）

另一個問題在于生產類器官所使用的昂貴的生長因子，在體內環(huán)境中，生長因子由基質細胞產生和作用，而在類器官中，我們需要持續(xù)高濃度的生長因子供應，這無疑提高了整個生產成本。

在靜態(tài)培養(yǎng)中，類器官擴散受限于氧氣供應。于是作者提出使用透氧性材料如聚二甲基硅氧烷（PDMS）用于培養(yǎng)，可以顯著增強細胞間組織和ECM產量。ECM產量的增多進一步提升了細胞團簇的密度。同時，使用透氧性材料可以保持氧氣濃度，保證細胞進行有氧呼吸。在懸浮培養(yǎng)中，異質細胞的團簇是難以形成的，不過通過某些分子的添加（如Eudragit），可以加強細胞的附著性。

另一個高效生產的方向是高密度團簇培養(yǎng)，補料分批透析培養(yǎng)來源于傳統(tǒng)的化學工程，是理想的的高效生產方法。這一方法可以增加細胞密度，清除出代謝產物，并通過激發(fā)旁分泌和自分泌有效降低生長因子的成本。

使用透氧性材料培養(yǎng)（a）與補料分批透

總之，目前類器官和細胞團簇的大規(guī)模高效量產是一個亟需解決的問題，而作者相信隨著對細胞自主性的進一步理解，有助于解決上述問題。

血管系統(tǒng)和組織構建的策略
作者：Jinah Jang，Dong-Woo Cho：韓國浦項科技大學

人類的血管系統(tǒng)為人體器官提供各類養(yǎng)分，以維持人體的體內平衡。作者提出，生物打印重要的是如何將細胞按特定方式進行組合，打印后以誘導其自組裝，從而逐漸形成組織。多噴頭生物3D打印技術的提出可以有效幫助血管化的實現，通過不同內皮細胞的結構設計，可以構建出小尺寸血管通路。

雖然我們在技術上有所突破，但當制造組織級的結構，諸多問題還是需要克服的。例如打印過程的剪切應力、生長因子、如何提供生理學微環(huán)境都是目前的限制因素，作者還特別提到了打印結構和循環(huán)系統(tǒng)或是自身系統(tǒng)的端對端連接也是維持打印體的重要因素，也是目前的一大難點。

為應對以上的問題，作者提出模塊化的生物打印體可以作為突破的方向。根據不同的血管化策略（如自組裝、犧牲通道等方法）和血管尺寸（如分叉角度、曲折率等），將內皮細胞、基質細胞、細胞團簇和生物墨水等通過生物3D打印的方法搭建出結構體，輔以ECM生物墨水和同軸噴頭的應用，可以協(xié)助血管通道的快速形成，以構建出血管化組織。

作者提出，自動化生物3D打印技術可以源源不斷的提供細胞、功能以及所需的微環(huán)境，以實現大尺寸組織的構建，隨著工藝不斷進步，相信我們距離臨床治療和病理研究會有更深層次的理解和應用。

用于疾病研究的體外生物學模型
作者：Minghao Nie，Shoji Takeuchi：日本東京大學

在藥物研究中，研究人員往往需要精準調控的體外三維細胞模型來準確判斷藥物反應。生物3D打印概念的提出，讓這樣的體外模型成為可能。

作者從兩個案例中討論3D打印體外生物學模型存在的問題：

1. 皮膚的多層屏障的作用是控制外用藥物的從表皮層到真皮層下毛細血管的透皮遞送。例如化妝品的毒性檢測需要測量其中有害物質從皮膚到血液中的滲透量。為了可以實現這一功能，體外的皮膚模型應該具有分化完好的表皮層、由沉積膜構成的表皮-真皮屏障、成纖維細胞填充的真皮層和內皮細胞構成的內皮層。目前技術所制造的皮膚模型由成纖維細胞填充的膠原蛋白晶格（FPCL）的收縮構成，但是尚未實現毛細血管進入FPCL之中，可以實現穩(wěn)定毛細血管灌注的FPCL是下一步皮膚模型構建的難點。

2. 受力形變較大是骨骼肌和心肌組織的一大特點，而由于跟腱結構的缺失，3D打印的組織收縮運動往往較小，同時，目前缺乏加入神經細胞的肌肉組織，以實現更真實的體外肌肉組織模型。

作者提出，通過混合3D打印非生命部件如高分子或電極和細胞結構可以解決以上的技術難題，通過將兩者的優(yōu)點相融合，實現具有刺激和反饋的組織結構。例如在皮膚模型中，加入可以犧牲的尼龍線材已形成血管網絡；亦或是在構建肌肉模型中，通過3D打印柱陣充當錨碇系統(tǒng)，并在此之間打印肌肉細胞，以達到更大收縮力。

具有血管通路的皮膚模型

具有錨碇系統(tǒng)的肌肉組織

總的來說，生物3D打印是一個十分靈活的技術，可以根據應用的不同，調整技術細節(jié)，以達到“為我所用”的目標。

器官芯片的開發(fā)
作者：Serge Ostrovidov，Ali Khademhosseini：美國加利福尼亞大學洛杉磯分校

器官芯片（Organ-On-A-Chip）是將微流控系統(tǒng)和生物細胞相結合，體外研究其生物學關系的方法。這種方法優(yōu)于常規(guī)的組織培養(yǎng)模型，并可以提供藥物篩選數據和器官間關系的復雜生理狀況。目前我們可以成功制作內皮細胞芯片、心肌細胞芯片、腫瘤芯片等各種器官芯片，其最終形態(tài)是將各器官的芯片組合起來形成人體的體外模型。

作者提出，從芯片角度來說，細胞如何在體外實現功能性是一個難點。同時，由于藥物檢測時往往要研究各器官的關系，一個可以為所有器官提供營養(yǎng)的培養(yǎng)基也是需要的。并且，在器官芯片上實現實時監(jiān)控也是必要的，這需要多重傳感器安裝在芯片上以實現自動化的反饋。

從3D打印角度來說，生物墨水仍然是最大的問題之一，墨水需要保證細胞在其中均勻懸浮且具有良好的打印性，并能提供養(yǎng)分。而對于較大的組織，血管化是目前需要克服的一大難題。

為應對上述問題，目前研究者開發(fā)了多材料生物墨水，可以實現多種細胞的混合打印。從打印工藝來說，同軸打印也是實現血管結構的關鍵技術；數字微鏡設備與CT結合的生物3D打印技術可以有效幫助實現大尺寸異質組織結構的血管化。近期已經有相關研究成功制造出同時具有肝臟、心臟和肺的多器官芯片，并安裝生物傳感器，以檢測實時反饋。

多材料生物打印

多器官芯片

隨著生物3D打印技術的逐漸開發(fā)，器官芯片也向著更復雜和更高的仿真度方向發(fā)展，隨著人類干細胞的應用，相信器官芯片會在醫(yī)藥產業(yè)有更深遠的影響。

多細胞工程生命系統(tǒng)
作者：Roger D Kamm：美國麻省理工學院

多細胞工程生命系統(tǒng)（MulticellulcarEngineered Living Systems, M-CELS）最早有日本的Yamanaka教授提出，隨著生物3D打印和微流控技術的發(fā)展，在最近10年內有著長足的發(fā)展，是未來生物醫(yī)藥企業(yè)的有力而高效的工具。

M-CELS的制造往往分為兩種，一種是將細胞接種到基質之中，以實現其功能，不需要細胞之間的互動；第二種是充分利用細胞的自主性進行分化和自組裝。其中第二種方法還有許多未知和難題需要探尋和克服。如何實現自組裝，甚至于自修復的組織結構是未來的方向。

M-CELS的生產路徑圖

想要實現M-CELS的構建，需要開發(fā)全新的生物打印工藝。要開發(fā)新的工藝，有幾點難題需要攻克。其中一個就是生物學系統(tǒng)的內在機理很多還是未知的，而當前的設計和制造原則是基于已知的各種部件間的相互作用。例如，我們不甚理解一組肌肉細胞如何自組裝形成肌肉組織，并可以產生集體收縮。不過即使我們不理解，我們可以創(chuàng)造條件，通過將它們放置在足夠接近的位置，使他們自發(fā)性的相互作用。同時作者提出，例如復雜的腦類器官，如何形成血管化是一大難題。而如何實現自我修復、自我復制的生物學系統(tǒng)是更進一步需要解決的問題。

作者相信隨著計算機輔助方法的加持，通過預測打印完成的機構體可以有效的構建合格的M-CELS。然而，作者同樣認為，我們應該進一步理解整個類器官的原理，并且重新審視生物3D打印的潛能，以實現進一步突破。

太空上的生物3D打印
Vladimir Mironov：俄羅斯莫斯科第一國立醫(yī)科大學
Lorenzo Moroni：荷蘭馬斯特里赫特大學

隨著生物3D打印技術的逐漸壯大，美國、中國、歐盟和俄羅斯均開始嘗試在太空進行生物打印研究。對于太空上進行生物3D打印，作者提出，微擠出式打印機依然是最常用的打印方法，打印出來的結構體暴露在太空的微重力和輻射環(huán)境下，用于研究其生物學和生理學功能。

最近，研究者們開發(fā)出了另一種磁懸浮生物打印方法，通過磁化細胞在磁場中打印，以克服微重力所帶來的打印問題。通過磁場的設計，這一工藝可以實現免支架、免噴嘴的快速打印，在太空這一特定環(huán)境下，是一種十分有吸引力的新工藝。

能夠升入太空的打印設備、墨水需要嚴格的設計和管控，以確保宇航員的安全，所以太空級生物3D打印機需要緊湊、極高的自動化和客戶友好性。

專為太空生物打印設計的磁懸浮打印機

太空輻射被視為人類太空探索的一大障礙，特別是建立可持續(xù)的行星定居點的深空旅行。生物3D打印的人體組織結構可以作為一種用于監(jiān)測太空輻射及其影響的前哨兵。我們已知人體的高度增值組是具有放射敏感性的，因此，干細胞，骨髓，以及生殖器官如卵巢和睪丸等器官是太空中主要打印和研究的對象。

總之，太空上的生物3D打印是極富挑戰(zhàn)性的研究方向，也具有諸多潛力，相信隨著技術的進步，我們距離在太空的定居又進一步。


生物3D打印工藝
作者：IbrahimT Ozbolat：美國賓夕法尼亞州立大學
生物3D打印工藝往往可以分為微滴式、微擠出式、激光光刻式打印工藝。每種打印工藝都有其優(yōu)點和局限性：

微滴式工藝通過超聲或微閥的方法產生連續(xù)或非連續(xù)的微滴機構，噴射在打印平臺上，具有較高的精度和速度。但其適用的材料往往局限于低黏度材料，并且細胞密度往往不高，因為此類打印容易造成噴頭堵塞。

微擠出式工藝通過擠出外力（氣動或電動）將材料通過噴嘴擠出成連續(xù)的絲材，并堆積成結構，適用于多種細胞和墨水，是最常使用的生物3D打印工藝。但其精度往往不夠高，100微米的精度已經是其極限，而對于細微結構的打印，微擠出式工藝難以勝任。

激光光刻式打印工藝是通過光的照射固化，大面積堆積形成結構，其精度較高。但由于其利用光進行固化交聯，所以其材料的應用范圍大大被縮減，而且其打印出的結構生物仿生性和細胞密度均較低。

不過隨著技術的進步，我們有了更多的工藝和技術來突破上述工藝的難題。例如近期Feinberg Lab提出的FRESH懸浮膠打印，可以實現高精度的打��；Burdick Lab開發(fā)出原位光固化技術，實現墨水在噴嘴擠出前瞬間實現光固化，大幅提高其打印精度；又如LIFT光固化打印工藝的提出，可以實現復雜管狀結構的打��；研究人員還將墨水通過微滴噴射到靜電紡絲中，亦或是通過聲泳技術，以解決其工藝的低黏度限制。

新興的生物3D打印工藝

總的來說，生物3D打印工藝不斷進步，各技術相互融合以實現各類復雜高精度結構的構建。

總結
這篇綜述性文獻可謂是集結了生物3D打印領域的半壁江山，而本篇文獻的意義也正如本篇文章的策劃人孫偉教授所言：生物3D打印的方法論和技術水平持續(xù)發(fā)展，其應用領域也在不斷地升級和變換，生物3D打印路線圖旨在通過提供詳實的總結和建議，幫助行業(yè)資深和新入的研究人員一個思路和方向。

參考文獻

Sun, Wei, Binil Starly, Andrew C. Daly, Jason A. Burdick, Jürgen Groll, Gregor Skeldon, Wenmiao Shu et al. "The bioprinting roadmap." Biofabrication 12, no. 2 (2020): 022002.

目前官網原文免費開放下載啦https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ab5158