以“結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能”視角分析生物墨水增強(qiáng)策略

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水凝膠作為一種高含水的三維高分子網(wǎng)絡(luò)，其在結(jié)構(gòu)上模擬細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供“支架”結(jié)構(gòu)，是生物3D打印常用的墨水材料。作為載體材料，水凝膠的性質(zhì)決定了生物3D打印的成敗與質(zhì)量，其需要具有良好的可打印性并能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜微環(huán)境。然而，普通水凝膠的交聯(lián)網(wǎng)不夠均勻且缺乏能量耗散機(jī)制使其機(jī)械性能較差，無(wú)法成為兼顧可打印性及生物相容性的“好用”生物墨水。

近期，美國(guó)德州農(nóng)工大學(xué)Akhilesh K. Gaharwar教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Materials上發(fā)表綜述文章：Hydrogel BioinkReinforcement for Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies。該文首先介紹生物墨水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如何影響其流變特性、機(jī)械強(qiáng)度以及生物學(xué)特性，接著重點(diǎn)綜述現(xiàn)有生物墨水增強(qiáng)機(jī)理及其對(duì)生物墨水關(guān)鍵性能的影響，最后給出了幾種有前景的下一代生物墨水設(shè)計(jì)方法。該綜述通過(guò)深入分析生物墨水“結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能”的關(guān)系來(lái)指導(dǎo)墨水設(shè)計(jì)，這種自下而上的視角為生物3D打印提供了以材料為中心的生物墨水設(shè)計(jì)思路。

一、生物墨水的基本特性
首先需要探討生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、流變特性、生物力學(xué)和生化特性。這些特性以復(fù)雜的方式相互關(guān)聯(lián)，在優(yōu)化生物墨水性能時(shí)必須予以考慮。隨著研究深入，這些領(lǐng)域中某些因素已被認(rèn)為對(duì)生物墨水性能至關(guān)重要（例如剪切稀化和彈性模量），一些因素仍在評(píng)估中（例如剪切恢復(fù)和應(yīng)力松弛）。盡管這些因素在文獻(xiàn)中并未得到一致報(bào)道，但在物墨水設(shè)計(jì)時(shí)仍應(yīng)重點(diǎn)研究。

圖1 生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、流變特性、生物力學(xué)及生化特性在打印中的相互作用

1. 生物墨水的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
（1）交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
經(jīng)典的聚合物三維網(wǎng)絡(luò)通過(guò)兩種方式形成：a單體溶液的聚合和交聯(lián)；b現(xiàn)有聚合物交聯(lián)。兩種方法通常都包含密集和稀疏交聯(lián)區(qū)域的隨機(jī)分布，這種異質(zhì)性導(dǎo)致受力時(shí)局部應(yīng)力集中，從而在聚合物網(wǎng)絡(luò)中形成較弱的破壞區(qū)域。因此，交聯(lián)點(diǎn)分布是決定聚合物網(wǎng)絡(luò)機(jī)械性能的關(guān)鍵。交聯(lián)度增加意味著異構(gòu)網(wǎng)絡(luò)變多，這使水凝膠變硬、變脆，而低交聯(lián)度水凝膠表現(xiàn)為軟、韌。
（2）斷裂與能量耗散
當(dāng)前的生物墨水文獻(xiàn)通常僅通過(guò)一些機(jī)械參數(shù)來(lái)表征凝膠，例如斷裂應(yīng)變、應(yīng)力以及壓縮、拉伸或剪切模量。這些參數(shù)固然重要，但僅部分描述了水凝膠的機(jī)械性能。對(duì)于比較聚合物網(wǎng)絡(luò)中的總體機(jī)械性能，特別有用的參數(shù)是斷裂能。

水凝膠與其他柔軟的聚合物網(wǎng)絡(luò)具有許多結(jié)構(gòu)相似性，但它們的水合結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其機(jī)械性能在關(guān)鍵方面有所不同。在所有的軟聚合物網(wǎng)絡(luò)中，固有斷裂能取決于裂縫平面處聚合物鏈的長(zhǎng)度、數(shù)量和鍵強(qiáng)度。交聯(lián)可增加彈性模量和拉伸強(qiáng)度，但會(huì)降低斷裂能和可延展性。這些因素一起嚴(yán)重限制了常規(guī)水凝膠的機(jī)械性能。


2. 生物墨水的流變特性和流動(dòng)模型
（1）牛頓模型
通常在牛頓流體模型中對(duì)在打印條件范圍內(nèi)保持一致黏度的生物墨水進(jìn)行建模，其中剪切速率（γ）等于剪切應(yīng)力（τ）除以黏度（K）。但是，大多數(shù)用于擠出3D打印的生物墨水都是非牛頓流體，它們的表觀黏度取決于剪切速率或變形歷史。非牛頓效應(yīng)通常是由于長(zhǎng)聚合物鏈的重新取向和靜電相互作用的破壞而引起，這是增強(qiáng)型生物墨水的常見(jiàn)特征。

（2）冪模型
在剪切稀化的生物墨水中，增加剪切速率會(huì)迫使聚合物鏈沿流向?qū)�齊，從而降低表觀黏度。在較高剪切速率下靜電相互作用的破壞也降低了表觀黏度。剪切稀化特性對(duì)生物打印有益，因?yàn)榇蛴∵^(guò)程中剪切應(yīng)力較低，降低了對(duì)細(xì)胞的損傷。
模擬剪切稀化行為的最簡(jiǎn)單方法是利用冪律關(guān)系（圖1），其中剪切應(yīng)力（τ）與剪切速率（γ）通過(guò)流動(dòng)行為指數(shù)（n）和稠度指數(shù)（K）得出。在該模型中，牛頓流體的n = 1，而n值<1則將呈現(xiàn)剪切稀化。冪模型對(duì)于在打印條件下的許多生物墨水非常有用。

（3）Herschel Bulkley模型
許多非牛頓生物墨水還表現(xiàn)出黏彈性，其特點(diǎn)是存在一個(gè)屈服應(yīng)力。屈服應(yīng)力是引發(fā)流動(dòng)所需的最小應(yīng)力。打印的保真度受屈服應(yīng)力影響�？梢酝ㄟ^(guò)在流動(dòng)輪廓的中心產(chǎn)生活塞流，從而在擠出過(guò)程中使包封的細(xì)胞免受剪切力的影響，此時(shí)剪切力被限制在沿?cái)D出機(jī)壁的狹窄區(qū)域內(nèi)。

高屈服應(yīng)力使生物墨水難以使用，不利于移液和細(xì)胞分散操作。屈服應(yīng)力的變化已在一系列生物墨水中被注意到，其可改善生物墨水的可打印性和細(xì)胞存活率。Herschel-Bulkley模型中τ0為屈服應(yīng)力，低于此值，生物墨水將表現(xiàn)為固體。Herschel-Bulkley流體模型可以準(zhǔn)確地描述出剪切稀化和屈服應(yīng)力的非牛頓流體行為。

（4）Carreau方程
可以使用更復(fù)雜的模型來(lái)表征生物墨水的行為，如Carreau方程，該方程對(duì)于描述非常低和高剪切速率下生物墨水的不同流動(dòng)行為特別有用。當(dāng)剪切速率太低而無(wú)法克服聚合物鏈的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)方向時(shí)，流體被視為具有恒定黏度的牛頓流體，而在中等剪切速率下則被視為冪流體。在較高的剪切速率下，它們?cè)俅巫優(yōu)榕ｎD流體。該模型最近用于表征聚丙交酯微纖維增強(qiáng)藻酸鹽生物墨水的流動(dòng)行為。

（5）現(xiàn)有模型局限性
盡管現(xiàn)有的流動(dòng)模型可以幫助預(yù)測(cè)打印過(guò)程中的生物墨水行為，但擠出后的剪切恢復(fù)變得很重要，但在這些模型中并未考慮在內(nèi)。

當(dāng)前的流動(dòng)模型對(duì)于結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)篩選潛在的生物墨水非常有用。最新研究表明，剪切稀化、屈服應(yīng)力和快速剪切恢復(fù)是生物墨水可打印性的關(guān)鍵因素。

3. 生物墨水的生物力學(xué)特性
（1）宏觀尺度
宏觀上，生物3D打印的最終目標(biāo)是植入人體，這使多數(shù)生物墨水難以達(dá)到相匹配的械性性能，包括剛度、黏彈性和屈服應(yīng)力/應(yīng)變。例如，軟組織植入物需要維持與周圍組織相似的壓縮水平，而不會(huì)被破壞或與周圍組織分離。在生物打印中，水凝膠在擠出后還必須能夠支撐自身，而不會(huì)出現(xiàn)明顯的塌陷或變形。

（2）細(xì)胞尺度
除了宏觀尺度，細(xì)胞感知尺度的機(jī)械性能在組織再生中也起著重要作用。彈性模量（或剛度）會(huì)深刻影響封裝細(xì)胞的行為，例如，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的基質(zhì)剛度依賴性分化。此外，更復(fù)雜的黏彈性能也顯著引導(dǎo)細(xì)胞行為。例如，與純彈性水凝膠相比，顯示出應(yīng)力松弛的黏彈性水凝膠即使較軟也能促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖�？焖俚膽�(yīng)力松弛會(huì)增加MSC的增殖、擴(kuò)散和成骨分化。


4. 生物墨水的生理穩(wěn)定性和生化相互作用
水凝膠的生化環(huán)境涉及生物力學(xué)性能。例如，細(xì)胞可以通過(guò)整合素蛋白感知基質(zhì)的剛度，因此沒(méi)有整合素結(jié)合位點(diǎn)的水凝膠會(huì)減少細(xì)胞對(duì)基質(zhì)剛度的反應(yīng)。另外，生物降解性是水凝膠設(shè)計(jì)中的重要因素。水凝膠將隨著時(shí)間的推移被再生組織取代，其降解速率應(yīng)與組織再生速率相匹配。

二、現(xiàn)有生物墨水增強(qiáng)策略
早期3D打印水凝膠只是在機(jī)械性能和細(xì)胞相容性之間折衷。隨著生物3D打印技術(shù)的發(fā)展，已出現(xiàn)了許多增強(qiáng)型生物墨水材料。他們采用了例如聚合物功能化、超分子增強(qiáng)、納米復(fù)合材料等增強(qiáng)等方式。這些方法通過(guò)多種不同渠道改善了水凝膠的機(jī)械性能，包括加強(qiáng)交聯(lián)、使應(yīng)力分布均勻以及通過(guò)犧牲鍵耗散機(jī)械能等。

圖2 水凝膠生物墨水增強(qiáng)方式

1. 聚合物功能化及雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
（1）甲基丙烯酸酯功能化
作為最廣泛使用的方法之一，甲基丙烯酸酯基團(tuán)修飾聚合物在其主鏈上引入雙鍵，這使聚合物可在光引發(fā)劑存在下進(jìn)行光交聯(lián)。例如，常用的甲基丙烯酰化明膠（GelMA）在維持明膠許多基本生物活性及溫敏性的同時(shí)賦予其光交聯(lián)性。光交聯(lián)的GelMA在體溫下穩(wěn)定，具有較高的斷裂能，更耐降解，并且可以通過(guò)選擇性曝光進(jìn)行圖案化，用于光固化3D打印。甲基丙烯酸酯化也已應(yīng)用于多糖，包括透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖等。

（2）點(diǎn)擊化學(xué)及其他方法
點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)有高活性并且可在溫和的條件下進(jìn)行的特點(diǎn)。其中最常見(jiàn)的為硫醇-雙鍵點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。硫醇-雙鍵點(diǎn)擊反應(yīng)為逐步增長(zhǎng)反應(yīng)，其不受氧的抑制且速率很高。這種快速交聯(lián)特性可通過(guò)在擠出的幾秒鐘之內(nèi)固化生物墨水來(lái)改善可打印性，從而減少結(jié)構(gòu)下垂。

此外，還有用于生物墨水的非光交聯(lián)劑。例如，酪氨酸酶已被用作光引發(fā)劑的替代物，以催化膠原和明膠的交聯(lián)來(lái)增強(qiáng)生物墨水。

2.超分子生物墨水

圖3 超分子作用生物墨水機(jī)理

（1）主-客體作用
主-客體作用是一種可逆的動(dòng)態(tài)鍵合方式，最常見(jiàn)的便是β-環(huán)糊精與金剛烷間的特異性結(jié)合�；�于主-客體作用的水凝膠具有剪切稀化及自愈合性能，這有利于擠出打印。盡管主-客作用具有特殊性質(zhì)，但是水會(huì)削弱主-客體間結(jié)合力，隨著時(shí)間的流逝，超分子部分容易受到蠕變和侵蝕的影響。此外，主-客體作用制備的凝膠往往機(jī)械性能較差，因此它經(jīng)常與共價(jià)鍵交聯(lián)結(jié)合使用。

（2）超分子作用
其他類型的超分子作用如氫鍵、π-π堆積、多肽及DNA類型的超分子水凝膠等。這些類型超分子作用由于其制備過(guò)程復(fù)雜或機(jī)械性能較難滿足3D打印需求因而研究較少。

3. 互穿網(wǎng)絡(luò)
互穿網(wǎng)絡(luò)（IPN）通過(guò)高度異質(zhì)的水凝膠結(jié)構(gòu)提高了斷裂能、韌性和剛度。IPN由兩個(gè)單獨(dú)的聚合物網(wǎng)絡(luò)組成，這些聚合物網(wǎng)絡(luò)通過(guò)共價(jià)或離子交聯(lián)結(jié)合在一起（圖 4）。

圖4 基于互穿網(wǎng)絡(luò)的生物墨水原理圖

（1）離子-共價(jià)鍵糾纏網(wǎng)絡(luò)
在生物墨水中，最有常見(jiàn)IPN是通過(guò)離子-共價(jià)鍵糾纏（ICE）形成的。對(duì)于生物打印應(yīng)用而言，傳統(tǒng)的共價(jià)鍵雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。ICE水凝膠由離子交聯(lián)的剛性聚合物和共價(jià)交聯(lián)的彈性聚合物形成。使用兩種不同的交聯(lián)機(jī)制大大減少了形成IPN所需的時(shí)間。

（2）雙重網(wǎng)絡(luò)
雙重網(wǎng)絡(luò)為兩個(gè)相互獨(dú)立的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，一般為兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)使用不同交聯(lián)方式，相互之間的交聯(lián)不干擾。與任一單獨(dú)組分網(wǎng)絡(luò)相比，雙網(wǎng)絡(luò)凝膠的機(jī)械性能表現(xiàn)的更為優(yōu)秀。

互穿網(wǎng)絡(luò)通過(guò)使用脆性犧牲網(wǎng)絡(luò)與可擴(kuò)展第二網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，在較寬的損壞區(qū)域內(nèi)分配應(yīng)力來(lái)提高機(jī)械性能。由于其交聯(lián)快速及可恢復(fù)的機(jī)械性能而被用于生物打印。物理交聯(lián)聚合物通常也是黏度調(diào)節(jié)劑，同時(shí)改善了可打印性。


4. 納米復(fù)合

圖5 納米復(fù)合增強(qiáng)水凝膠生物墨水

由于納米材料的高比表面積，即使用量很少也可以顯著影響水凝膠網(wǎng)絡(luò)的性能。納米材料的摻入已被用來(lái)向生物墨水添加新的功能，例如增強(qiáng)電導(dǎo)率、刺激響應(yīng)能力、對(duì)細(xì)胞行為的控制、改善打印性和機(jī)械性。

常用的納米材料有石墨、碳納米管、納米粘土、磁性納米顆粒、過(guò)渡金屬二硫?qū)倩�物和聚合物納米顆粒等。增強(qiáng)機(jī)制可能會(huì)根據(jù)納米粒子的大小、形狀和表面化學(xué)性質(zhì)而有所不同。通常認(rèn)為納米顆粒是通過(guò)充當(dāng)跨越多個(gè)聚合物鏈的可逆交聯(lián)劑而增強(qiáng)水凝膠的。這樣可以使應(yīng)力有效地分散到整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，并通過(guò)破壞納米粒子與聚合物間的交聯(lián)而耗散能量。應(yīng)力分散避免了大范圍的裂紋擴(kuò)展，這種機(jī)理已被證明可以提高水凝膠的強(qiáng)度和韌性。

三、下一代生物墨水增強(qiáng)策略

圖6 水凝膠生物墨水增強(qiáng)的前沿技術(shù)

1. 多組分生物墨水
顧名思義，將多種交聯(lián)、增強(qiáng)方式組合使用，進(jìn)而獲得具有特殊性能的生物墨水。盡管各種增強(qiáng)方式實(shí)現(xiàn)過(guò)程不同，但是這些增強(qiáng)策略背后的機(jī)制并不是相互排斥的，往往可以與其他方法結(jié)合使用。組合使用后可以彌補(bǔ)各自缺點(diǎn)并整合不同增強(qiáng)機(jī)制的優(yōu)勢(shì)。


2. 滑動(dòng)環(huán)交聯(lián)生物墨水
單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的弱點(diǎn)之一是非均一的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致應(yīng)力集中在最短的鏈上。使用機(jī)械互鎖的分子，包括滑動(dòng)環(huán)交聯(lián)體系，如聚輪烷等可有效避免應(yīng)力集中。這些環(huán)動(dòng)態(tài)地跨鏈滑動(dòng)，在交聯(lián)點(diǎn)間均勻地分配應(yīng)力，從而使水凝膠具有出色的可延展性和高斷裂強(qiáng)度。


3. 基于微凝膠的生物墨水
基于水凝膠微球的生物生物墨水格外引人注目。水凝膠微球密集堆積或填充于液體中，微球間的接觸面可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而形成大塊凝膠。這種方法可控制孔隙率，從而創(chuàng)建高度互連的微孔支架，同時(shí)還可為細(xì)胞提供特殊的微環(huán)境。微球還可包載不同細(xì)胞，進(jìn)而構(gòu)建多細(xì)胞支架。然而，微球可打印性的影響因素仍然知之甚少。包括微球尺寸、多分散性、堆積密度、表面相互作用等。

總結(jié)
水凝膠生物墨水的生物學(xué)活性與機(jī)械性能通常比較矛盾。細(xì)胞的生長(zhǎng)往往需要稀疏的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)以便養(yǎng)分傳輸，而強(qiáng)度和可打印性則需要更高的聚合物濃度。這些矛盾的需求推動(dòng)了對(duì)更高級(jí)水凝膠結(jié)構(gòu)的研究。常規(guī)的單網(wǎng)絡(luò)水凝膠因其不均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而引起的應(yīng)力集中，這削弱了凝膠的強(qiáng)度。將機(jī)能量耗散機(jī)制整合到水凝膠結(jié)構(gòu)中可顯著提升凝膠機(jī)械性能。

隨著細(xì)胞行為與材料間相互作用的研究，生物墨水增強(qiáng)技術(shù)愈發(fā)重要。多種組合技術(shù)可能具有協(xié)同作用，微球生物打印和滑環(huán)交聯(lián)等新方法也正在被積極研究。

參考文獻(xiàn)：
[1] Chimene D, Kaunas R, Gaharwar AK. Hydrogel Bioink Reinforcementfor Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies [J]., 2020,32(1): 1902026.