頂刊綜述：再談“生物3D打印-從形似到神似”

作者： 高博士
來源：EngineeringForLife

相比于傳統(tǒng)組織工程方法，新興的生物3D打印技術(shù)可對(duì)載細(xì)胞的生物材料進(jìn)行精確控制，這為構(gòu)建仿生結(jié)構(gòu)和組織再生提供了新思路。自生物3D打印概念提出以后，關(guān)于生物墨水、打印方法及打印裝備的研究層出不窮，這也極大地促進(jìn)了生物3D打印技術(shù)的蓬勃發(fā)展。然而，生物3D打印發(fā)展到今天，很多學(xué)者開始思考：體外構(gòu)建真正具有生物功能的組織結(jié)構(gòu)，到底需要什么樣的生物墨水和打印方法？還有哪些因素需要考慮？因此，為了實(shí)現(xiàn)生物3D打印的功能化突破和應(yīng)用，該領(lǐng)域的研究導(dǎo)向逐漸從關(guān)注結(jié)構(gòu)成形（“形似”）過渡到注重生物功能的形成（“神似”）。

EFL團(tuán)隊(duì)在18年發(fā)表的綜述論文上，特別闡述了“生物3D打印-從形似到神似”的觀點(diǎn)。近兩年，隨著生物3D打印的發(fā)展，涌現(xiàn)了很多以生物功能為目標(biāo)的研究工作。為此，很多團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)總結(jié)了生物3D打印技術(shù)的最新進(jìn)展，例如，2019年4月，哈佛醫(yī)學(xué)院Yu Zhang教授在Small上發(fā)表的“3D Bioprinting: from Benches to Translational Applications”綜述文章，以及2020年2月，烏得勒支大學(xué)Jos Malda教授在Advanced Materials上發(fā)表的“From Shape to Function：The Next Step in Bioprinting”綜述文章。在此，筆者期望通過這兩篇綜述論文，結(jié)合EFL團(tuán)隊(duì)的思考，再次梳理下生物3D打印從“形似”到“神似”的研究進(jìn)展。

內(nèi)容概覽

一、“形似”研究進(jìn)展
生物墨水是成功打印組織和器官結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。一般來說，生物墨水應(yīng)該兼具可打印性和生物相容性�？纱蛴⌒灾干�物墨水適合制造具有高結(jié)構(gòu)完整性和保真度的3D結(jié)構(gòu)，而生物相容性表示生物墨水對(duì)細(xì)胞友好，并支持細(xì)胞粘附、增殖和鋪展。圍繞這個(gè)目標(biāo)，生物3D打印研究初期，主要是選用生物水凝膠作為打印墨水，包括天然水凝膠和合成水凝膠。接著將通用增材制造原理應(yīng)用于載細(xì)胞的水凝膠打印，開發(fā)出了多種生物3D打印方法，包括：光固化生物3D打印、噴墨生物3D打印、激光直寫生物3D打印、擠出式生物3D打印機(jī)以及電紡絲生物3D打印（如圖1），這些方法都有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)、局限性以及適用范圍，這里不再贅述。

圖1 典型的生物3D打印技術(shù)：（A）光固化生物3D打��；（B）噴墨生物3D打��；（C）激光直寫生物3D打印；（D）擠出式生物3D打印機(jī)；（E）電紡絲生物3D打印

生物3D打印的“形似”研究，主要圍繞以構(gòu)建高保真度結(jié)構(gòu)為目標(biāo)的生物墨水及打印策略設(shè)計(jì)。鑒于此，以材料適用范圍最廣的擠出式生物3D打印方法為例，重點(diǎn)介紹基于此目標(biāo)的墨水及打印方法設(shè)計(jì)策略。具體可分為聚焦墨水設(shè)計(jì)的策略：新的化學(xué)交聯(lián)思路、調(diào)節(jié)流變性能；以及聚焦重新設(shè)計(jì)墨水環(huán)境的打印策略；同軸/微流控打印、支撐浴懸浮打印。

1.新的化學(xué)交聯(lián)思路：精確控制墨水的交聯(lián)過程對(duì)于獲得具有高的形狀保真度至關(guān)重要。一種策略是通過采用階梯生長反應(yīng)來控制交聯(lián)的化學(xué)過程，例如基于硫醇-烯階梯生長反應(yīng)機(jī)理，對(duì)明膠進(jìn)行的烯丙基改性得到GelAGE。相比于�；�改性得到的GelMA，GelAGE表現(xiàn)出更快的反應(yīng)速率、更均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖2A）。另一種策略是通過控制交聯(lián)時(shí)間來保證形狀保真度，典型的例子是原位光交聯(lián)策略，將墨水吸入透光玻璃毛細(xì)管在擠出前進(jìn)行光交聯(lián)，擠出后可保持較好的微絲形態(tài)（圖2B）。此外，使用可見光引發(fā)劑（如LAP、Ru/SPS）代替紫外光引發(fā)劑（2959）也是一種既可提高交聯(lián)速度有能改善細(xì)胞活性的策略（圖2C）。

圖2 新的化學(xué)交聯(lián)思路：（A）階梯生長反應(yīng)得到的GelAGE與普通化學(xué)交聯(lián)的GelMA對(duì)比；（B）原位光交聯(lián)策略；（C）紫外光改為可見光引發(fā)策略

2.調(diào)節(jié)流變性能：調(diào)節(jié)墨水流變性能是一種常用的實(shí)現(xiàn)高形狀保真度的策略。早期的方法是通過增加聚合物濃度或者添加流變改進(jìn)劑實(shí)現(xiàn)。近期已開發(fā)出諸如逐步交聯(lián)、添加納米材料、以及構(gòu)建膠體墨水等策略。逐步交聯(lián)策略指兩種或兩種以上不同交聯(lián)方式的逐步交聯(lián)過程，執(zhí)行第一交聯(lián)步驟來調(diào)節(jié)墨水的流變特性，然后引入第二交聯(lián)步驟以確保結(jié)構(gòu)的長期穩(wěn)定性（圖3A）。另一種策略是在墨水中添加納米硅酸鹽，提高剪切變稀性能，同時(shí)誘導(dǎo)自我修復(fù)，提高形狀保真度（圖3B）。此外，近期出現(xiàn)了一種新的膠體墨水（將水凝膠加工成穩(wěn)定的、交聯(lián)的微凝膠混合體系），凝膠顆粒之間不斷增加的物理相互作用導(dǎo)致整體流變特性從粘度主導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥灾鲗?dǎo)的粘彈性行為（圖3C）。

圖3 調(diào)節(jié)流變性能：（A）逐步交聯(lián)策略；（B）納米材料輔助打印策略；（C）構(gòu)建膠體墨水策略

3.同軸/微流控打�。和�軸擠出通過使用同軸組裝的噴嘴，可以同時(shí)同心沉積不同材料，從而形成雙層或多層纖維(圖4A、B)。與普通的擠出方式相比，同軸擠出中的交聯(lián)劑和墨水溶液的空間分離允許使用較低粘度的墨水，同時(shí)保持高的形狀保真度。同軸系統(tǒng)非常適合于海藻酸鹽及其混合物的打�。�氯化鈣作為交聯(lián)劑）。此外，通過將海藻酸鹽與鈣溶液共打印來產(chǎn)生可灌注的血管結(jié)構(gòu)，同軸擠出為大組織的營養(yǎng)供給提供了有前途的解決方案(圖4C)。微流控系統(tǒng)可以在微尺度上精確操縱液體行為，可實(shí)現(xiàn)不同墨水的快速無縫切換(500ms)，這使得該方法成為通過改變不同材料的沉積時(shí)序來構(gòu)建漸變結(jié)構(gòu)的有效工具(圖4D)。

圖4 同軸/微流控打�。海ˋ、B）同軸打印策略；（C）EFL團(tuán)隊(duì)提出的同軸打印構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)；（D）微流控輔助打印梯度結(jié)構(gòu)

4.支撐浴懸浮打印：基于擠出打印將生物墨水在支撐浴材料內(nèi)沉積，利用支撐材料提供的中性浮力和空間約束，生物墨水可以很好保持形狀。通過消除重力和表面張力，能夠打印其他擠出方式不可能處理的低粘度墨水（圖5）。除了提高分辨率外，該方法還可以使打印的組織在潮濕的環(huán)境中保持長期穩(wěn)定性，減小制造過程中細(xì)胞損傷。支撐浴材料的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于要具有可控流變特性的非牛頓流體行為（當(dāng)噴頭運(yùn)動(dòng)對(duì)支撐浴產(chǎn)生剪應(yīng)力時(shí)，它必須局部液化；當(dāng)剪應(yīng)力消失后，它的粘度需要增加，以固定住墨水并支撐復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造）。此外，支撐浴材料還應(yīng)該是細(xì)胞相容的，易于去除，以及不能干擾墨水的交聯(lián)。

圖5 支撐浴懸浮打印

二、“神似”研究進(jìn)展
越來越多的生物打印策略為構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)提供方案，然而，解剖結(jié)構(gòu)的高保真生物打印方法并不能確保獲得天然組織的功能。當(dāng)細(xì)胞和材料的空間沉積得到很好的控制以后，生物結(jié)構(gòu)將需要經(jīng)歷成熟、形態(tài)形成等發(fā)育過程，這已被定義為生物打印過程的一個(gè)組成部分。然而，到目前為止，證明生物打印在組織水平上對(duì)生物功能進(jìn)化具有優(yōu)勢(shì)的研究例子仍然有限。其中一個(gè)原因是，專注于材料和工藝開發(fā)的研究經(jīng)常停留在概念驗(yàn)證，但沒有明確說明打印在最終功能應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)。

雖然構(gòu)建全功能的組織所需的確切相似度尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，根據(jù)細(xì)胞和材料組成以及多個(gè)成分之間的相互作用來控制打印結(jié)構(gòu)的形狀對(duì)于縮短工程組織和天然組織之間的差距至關(guān)重要。因此，生物3D打印的“神似”研究，主要圍繞以誘導(dǎo)細(xì)胞和組織功能為目標(biāo)的生物墨水及打印策略設(shè)計(jì)，包括功能性生物墨水開發(fā)、細(xì)胞來源匹配、以及新的打印策略設(shè)計(jì)。此外，還提出了生物打印與細(xì)胞自組裝協(xié)同策略。

1.功能性生物墨水開發(fā)：與簡(jiǎn)單添加生物活性化合物不同，一種更有效的方法是使用天然模板作為生物墨水。通過脫細(xì)胞和溶解來自脂肪、軟骨和心肌組織的ECM，已經(jīng)獲得了可打印的、細(xì)胞相容的dECM墨水。利用體內(nèi)常駐細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，可更好構(gòu)建細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞生存、粘附、擴(kuò)散、增殖、遷移、分化，以及組織形成和修復(fù)�；�于dECM墨水，已成功誘導(dǎo)特定組織生長，包括軟骨、心肌、脂肪和肝臟組織（圖6）。此外，生物墨水設(shè)計(jì)中還需添加多肽、蛋白等細(xì)胞所需活性物質(zhì)，可控釋放的活性載體物質(zhì)，以及誘導(dǎo)具有電生理特性組織再生的導(dǎo)電物質(zhì)等。

圖6 基于dECM墨水打印功能性組織結(jié)構(gòu)

2.細(xì)胞來源匹配：生物打印通常被定義為“利用3D打印技術(shù)操縱含有活細(xì)胞的材料”，因此，生物打印功能化的關(guān)鍵之一在于細(xì)胞的選用。生物打印的細(xì)胞來源包括：骨髓干細(xì)胞（MSCs）、脂肪干細(xì)胞（ASCs）、羊膜臍帶干細(xì)胞（AFSCs）等專能干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（IPSCs）等多能干細(xì)胞，以及患者自體細(xì)胞（圖7A）。根據(jù)所需的組織類型，相應(yīng)地選擇細(xì)胞，并為其提供最佳的微環(huán)境，使其能夠增殖、擴(kuò)散、分化。研究表明干細(xì)胞顯示出構(gòu)建特定功能結(jié)構(gòu)的高潛力，結(jié)合復(fù)雜結(jié)構(gòu)、梯度結(jié)構(gòu)、以及復(fù)合結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)生物3D打印組織特定功能的重建（圖7B-I）。

圖7 （A）細(xì)胞來源類型；（B-I）不同細(xì)胞打印應(yīng)用

3.新的打印策略設(shè)計(jì)：為了獲得用于臨床應(yīng)用的仿生組織，不僅需要功能性生物墨水和細(xì)胞源，而且需要將這些元素整合到更新的打印策略中，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)生物打印的功能化。近幾年，出現(xiàn)了以功能實(shí)現(xiàn)為目標(biāo)的新的打印策略，包括高精度打印、定向結(jié)構(gòu)打印、梯度/多材料打印、血管網(wǎng)絡(luò)打印、原位打印、4D打印。

1）高精度打�。簽榱梭w外構(gòu)建在細(xì)胞功能誘導(dǎo)上起關(guān)鍵作用的微/納結(jié)構(gòu)，需要提高生物打印技術(shù)的分辨率（圖8A）。將傳統(tǒng)靜電紡絲與3D打印結(jié)合產(chǎn)生的電紡絲生物3D打印技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)300nm纖維的打�。▓D8B-D）。此外，高精度纖維與水凝膠復(fù)合，可以產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)效果，有利于組織再生（圖8E-H）。

圖8 高精度打印：（A）傳統(tǒng)擠出得到的低分辨率結(jié)構(gòu)；（B-D）電紡絲生物3D打��；（E-H）電紡纖維/水凝膠協(xié)同增強(qiáng)

2） 異質(zhì)結(jié)構(gòu)打印：許多組織的功能歸功于它們的各向異性結(jié)構(gòu)，例如，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的信號(hào)傳遞，肌細(xì)胞束的力驅(qū)動(dòng)，骨骼承受機(jī)械負(fù)荷的能力，都是由細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)顯示的分層排列和優(yōu)先方向性驅(qū)動(dòng)的。因此，通過打印及墨水策略的特殊設(shè)計(jì)，進(jìn)行各向異性結(jié)構(gòu)的可控打印，可促進(jìn)定向組織的功能化（圖9）。

圖9 異質(zhì)結(jié)構(gòu)打印

3）梯度/多材料打�。航M織功能與不同類型細(xì)胞的持續(xù)相互作用以及組織界面緊密相關(guān)，例如，骨-軟骨界面、韌帶-骨界面。通過自混合打印噴頭設(shè)計(jì)來調(diào)節(jié)兩種生物墨水的體積比，可獲得具有連續(xù)梯度的組織結(jié)構(gòu)（圖10A）。通過將不同材料墨盒與單噴頭擠出系統(tǒng)或光固化系統(tǒng)集成，可實(shí)現(xiàn)不同墨水的快速連續(xù)切換（圖10B、C）。

圖10 梯度/多材料打印：（A）基于混合噴頭打印梯度結(jié)構(gòu)；（B）多材料擠出式打印；（C）多材料光固化打印

4）血管網(wǎng)絡(luò)打�。貉�管網(wǎng)絡(luò)打印是組織功能化的關(guān)鍵一步，打印策略設(shè)計(jì)的難點(diǎn)在于如何在生物組織打印過程中引入血管網(wǎng)絡(luò)。目前方法主要包括將多材料打印與血管化策略相結(jié)合（圖11A），基于支撐浴懸浮打印犧牲墨水并將支撐浴轉(zhuǎn)變?yōu)?D基質(zhì)（圖11B），以及開發(fā)多隔室的墨盒（圖11C）。

圖11 血管網(wǎng)絡(luò)打�。海ˋ）集成多材料和血管化打印策略；（B）支撐浴懸浮打印策略；（C）多隔室墨盒策略

5）原位打�。焊鷤鹘y(tǒng)的打印后再移植的思路不同，原位生物打印提供了一種將組織沉積在需要位置的新思路。原位打印依賴于在缺損中放置可以與周圍內(nèi)源性組織相容并誘導(dǎo)血管新生的組織類似物。目前策略包括集成3D掃描儀的打印系統(tǒng)（圖12A）以及手持式生物打印設(shè)備（圖12B），主要用于皮膚、軟骨缺損的修復(fù)。

圖12 原位打印：（A）集成3D掃描儀的打印系統(tǒng)；（B）手持式生物打印設(shè)備

6）4D打印：自然組織的獨(dú)特功能往往是由外界刺激引起的組織構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化形成的。例如，心臟規(guī)律跳動(dòng)調(diào)節(jié)全身血液循環(huán)，是由副交感神經(jīng)系統(tǒng)控制，并由電刺激下的心肌收縮驅(qū)動(dòng)。4D打印是在3D打印的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，打印的結(jié)構(gòu)可在外部刺激下隨時(shí)間改變其結(jié)構(gòu)。通常是在墨水中添加具有特殊響應(yīng)的功能材料實(shí)現(xiàn)的（圖13）。

圖13 4D打印

4.生物打印與細(xì)胞自組裝協(xié)同策略：事實(shí)上，在生物制造技術(shù)興起之前，融合發(fā)育生物學(xué)和工程學(xué)的發(fā)育工程技術(shù)（細(xì)胞自組裝）已成為推進(jìn)組織工程發(fā)展的新模式。其主要特征是從與體內(nèi)連續(xù)發(fā)育階段相對(duì)應(yīng)的順序子過程中進(jìn)行體外過程設(shè)計(jì)，這些子過程遵循細(xì)胞分化和組織生長的漸進(jìn)協(xié)調(diào)發(fā)展。自組裝的多細(xì)胞模塊形成是該技術(shù)的關(guān)鍵一步，但是如何能夠以受控的方式將中間模塊組裝成更大的組織單元是個(gè)很大的挑戰(zhàn)。因此，生物打印和細(xì)胞自組裝技術(shù)協(xié)同開發(fā)，可以極大地促進(jìn)工程組織的功能化。這可以通過兩種不同的方式實(shí)現(xiàn)(圖14)。其一，生物打印可以施加特定的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，允許祖細(xì)胞被打印成類器官結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生誘導(dǎo)進(jìn)一步自組織的條件，形成更大功能組織結(jié)構(gòu)的潛力。其二，祖細(xì)胞懸浮液可以自組織成亞毫米到毫米級(jí)的結(jié)構(gòu)，然后，這些只包含中等復(fù)雜性的結(jié)構(gòu)可以被生物打印成更復(fù)雜的組織和器官，其幾何形狀和圖案可用于指導(dǎo)功能組織的形成。

圖14 生物打印和細(xì)胞自組裝技術(shù)協(xié)同策略

目前通過生物墨水、打印技術(shù)、以及多種組織工程方式融合等解決復(fù)雜問題的工程方法，在生物打印功能化上取得了一些進(jìn)展。但是，復(fù)雜的工程系統(tǒng)（例如汽車、飛機(jī)或計(jì)算機(jī)）是可知的，可以通過定義的規(guī)則完全理解，并通過衍生的方法來處理它們，然后可以完全預(yù)測(cè)它們的行為。相反，由于存在太多的未知變量相互作用，復(fù)雜的生物系統(tǒng)不是完全可知的。我們不能只通過用于復(fù)雜工程系統(tǒng)的策略來處理它們，但可以通過觀察和研究生物系統(tǒng)如何發(fā)展和進(jìn)化的，來獲得一些理解。此外，隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)步，與復(fù)雜生物系統(tǒng)相關(guān)的新的機(jī)制也在不斷被發(fā)現(xiàn)。未來，對(duì)組織/器官再生過程中潛在的自組織機(jī)制的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用，將是功能性生物組織成功打印的關(guān)鍵。

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