電紡+近場直寫打印小直徑血管支架

來源：EngineeringForLife

血管移植，特別是小直徑血管(<6mm)的替換仍然是臨床醫(yī)學(xué)的一大主要挑戰(zhàn)。因?yàn)橹踩胛飼?huì)產(chǎn)生比如堵塞、內(nèi)膜增生或血栓相關(guān)問題。為促進(jìn)組織再生，血管支架還應(yīng)該引導(dǎo)細(xì)胞分化以獲得天然血管的功能。為此，支架必須引導(dǎo)管腔內(nèi)部內(nèi)皮細(xì)胞單層的形成以模擬血管內(nèi)膜。此外，還應(yīng)實(shí)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(vSMCs)的堆積和定向來模擬膜介質(zhì)的外層。到目前為止，如何設(shè)計(jì)與制造符合要求的支架來促進(jìn)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。為此烏得勒支大學(xué)的Debby Gawlitta和維爾茨堡大學(xué)的Jürgen Groll在Advanced Functional Materials上發(fā)表了“Heterotypic Scaffold Design Orchestrates Primary Cell Organization and Phenotypes in Cocultured Small Diameter Vascular Grafts”，文章介紹了一種由溶液電紡絲與熔融近場電直寫相結(jié)合的混合制造方法，制備了一種能模擬組織結(jié)構(gòu)的雙層復(fù)合管狀支架，其中包括內(nèi)層隨機(jī)定向的致密纖維網(wǎng)和外層定向可控的纖維。該支架能夠誘導(dǎo)細(xì)胞形成連續(xù)的管腔單層內(nèi)皮細(xì)胞和定向的平滑肌細(xì)胞層，從而促進(jìn)組織細(xì)胞特異性分化。并且該方法不需要額外的可溶性因子或支架表面的生物活化材料，說明異型支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的生長和分化。

血管支架有5個(gè)要求：

• 支架應(yīng)提供一種基底，使內(nèi)皮集落形成細(xì)胞（ECFCs）在其上形成單層。
• 支架上形成的內(nèi)皮細(xì)胞單層應(yīng)表達(dá)成熟的EC標(biāo)志物、基底膜成分和ECM，以及與vSMCs溝通相關(guān)的信號。
• 支架應(yīng)該具有一個(gè)多孔的外層，vSMCs可以在其中遷移和填充，以實(shí)現(xiàn)多層細(xì)胞組織的伸長。
• vSMCs應(yīng)以近圓周方向排列，具體由可由支架纖維的方向控制。
• 支架應(yīng)該為間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分化為vSMCs收縮表型提供環(huán)境
  

因此，研究人員提出一種混合工藝的復(fù)合血管支架制造工藝，如圖 1。首先由溶液電紡PCL纖維形成管狀支架內(nèi)層(孔隙率為80%±5%，內(nèi)徑3mm)，纖維直徑為1.4±0.2μm，纖維去向隨機(jī)分布。其次，用同樣的材料采用熔融近場電直寫的工藝制作外層，纖維直徑15.2±4.8μm，纖維纏繞角度在30°到70°之間，具有可控制的大孔徑。

圖1 雙層管狀支架的制造。A）溶液靜電紡絲制造管狀支架內(nèi)層。B）熔融電直寫將定向纖維沉積在管狀支架外層。C）雙層支架最終結(jié)構(gòu)。雙層支架由同種材料組成，不同尺寸的纖維融合在一起，防止分層。

支架的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2，成功將尚未內(nèi)皮化的ECFCs與MSCs共培養(yǎng)，并且ECFCs未滲透過孔徑非常小的溶液紡絲層。掃描電鏡(SEM)顯示相鄰的ECs(黑色箭頭)與纖維(白色箭頭)之間建立了連接，表明內(nèi)皮細(xì)胞受到限制，通透性較低。在體內(nèi)，具有屏障功能的內(nèi)皮細(xì)胞是抵抗血栓形成的關(guān)鍵。這樣就產(chǎn)生了具有抗凝血特性的內(nèi)層，類似于天然內(nèi)皮的特性。

同樣，單層膜顯示血小板黏附糖蛋白因子(vwF)內(nèi)皮標(biāo)記物染色陽性(圖2D)，并由iv型膠原陽性基質(zhì)(圖2E)支撐，這也天然基底膜中發(fā)現(xiàn)，說明了支架仿生性能。一氧化氮被認(rèn)為是主要的血管擴(kuò)張劑之一，參與抑制血小板聚集，是功能化內(nèi)皮細(xì)胞所必需的。在實(shí)驗(yàn)中中測量到的NO表明，當(dāng)在仿生雙層支架上培養(yǎng)時(shí)，所形成的內(nèi)皮細(xì)胞具有功能并具有向類vsm細(xì)胞發(fā)出信號的能力。

此外，大孔隙和較粗的近場電直寫纖維可以誘導(dǎo)類vsm細(xì)胞快速滲透，從而滿足MSC/ECFC共培養(yǎng)(圖2J)和MSC單培養(yǎng)。接種的MSCs覆蓋整個(gè)支架的外表面(圖2G)，并呈直線排列(圖2H)。IV型膠原也被合成(圖2I)，它將單個(gè)的vSMCs包裹成基底膜樣基質(zhì)。

圖2 雙層異質(zhì)血管支架上的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。A）的同時(shí)培養(yǎng)ECFCs (CD31 +)和vSM-like細(xì)胞(αSMA +)后17 天的分層組織 (橫斷面視圖)；B）溶液紡絲層上細(xì)胞的內(nèi)皮化；C）緊密的細(xì)胞連接(黑色箭頭)和細(xì)胞擠壓(白色箭頭)；D）和E）內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表達(dá)；F）內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)向vSM-like細(xì)胞傳遞信號；G） vSM-like細(xì)胞的定向排列；H）沿著纖維伸長的αSMA +細(xì)胞；I）IV型膠原在細(xì)胞排列方向的沉積；J）在7天后vSM-like細(xì)胞充滿了管壁，并呈圓周方向排列。除有特殊標(biāo)注外，比例尺為100μm。

對于近場電直寫的支架外層結(jié)構(gòu)，隨著支架纖維纏繞角的增加，細(xì)胞的方向改變?yōu)榻�周�?圖3A)，與原膜介質(zhì)相同。通過控制纖維的取向，可以模擬組織的方式引導(dǎo)管狀支架上的vSMCs的取向。外層的多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)了細(xì)胞的快速生長，并產(chǎn)生了幾層定向排列的細(xì)胞，細(xì)胞間具有密切相互作用。

圖3 熔融纖維取向?qū)﹂g充質(zhì)干細(xì)胞的影響。A)代表性支架植入前掃描電鏡圖像(上)和植入后培養(yǎng)7 天后 F-actin染色細(xì)胞 (下)。B)整個(gè)管壁厚度上的細(xì)胞以及熔融電直寫粗纖維的平均取向。

為了更深入地調(diào)查在大孔徑支架上增加的細(xì)胞相互間作用對MSCs分化的影響。研究人員比較具備與不具備外側(cè)熔融電直寫纖維的細(xì)胞結(jié)果。結(jié)果表明在孔板中與單層溶液紡絲支架上培養(yǎng)的MSCs具有相似的相對基因表達(dá)水平。而在雙層血管結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的MSCs與單溶液紡絲層培養(yǎng)的MSCs基因表達(dá)水平具有較大區(qū)別。DNA與蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是類似。

圖4 融合驅(qū)動(dòng)的MSCs向vSMCs分化結(jié)果。A）培養(yǎng)7 d和14 d后在孔板中與單層溶液紡絲支架上培養(yǎng)的MSCs相似的相對基因表達(dá)水平；B）培養(yǎng)7 d和14 d后，雙層血管結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的MSCs與單SES層培養(yǎng)的MSCs基因表達(dá)水平的比較；C-D）qPCR對比結(jié)果；E-H）細(xì)胞在單純?nèi)芤杭徑z支架與雙層異質(zhì)支架上的蛋白表達(dá)區(qū)別。

這種復(fù)合結(jié)構(gòu)的異質(zhì)支架具有類似于原生血管內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)側(cè)溶液紡絲層具有小直徑與低細(xì)胞通透性，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞層的形成；而低纖維密度、可控沉積定向的多孔外膜是實(shí)現(xiàn)類vsm細(xì)胞定向快速定植的基礎(chǔ)。不需要可溶性因子和表面功能化，緊靠放生的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，引導(dǎo)指導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)和分化。未來還可以探索是否可以利用這種異型設(shè)計(jì)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，使之朝著再生的方向發(fā)展。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.201905987