文獻(xiàn)精讀 | 3D打印半月板支架用于羊半月板再生

膝關(guān)節(jié)中的半月板是股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端髁間的新月形結(jié)締組織，主要起到吸收機(jī)械力的作用。半月板損傷后一般行半月板切除術(shù)或半月板移植物替代治療。半月板切除術(shù)容易暴露股骨和脛骨，進(jìn)而導(dǎo)致過度磨損，這是骨關(guān)節(jié)炎的高度易感因素。而骨關(guān)節(jié)炎又是心力衰竭，脊髓損傷，呼吸系統(tǒng)疾病和中風(fēng)中較為常見的慢性病因之一。一般來說，幾乎所有纖維軟骨組織的相關(guān)損傷和疾病，包括半月板，腱-骨連接處，脊柱的椎間盤和顳下頜關(guān)節(jié)的缺損均無法自發(fā)愈合。

與大多數(shù)其他復(fù)雜組織的再生相似，半月板再生的障礙是難以實(shí)現(xiàn)多種組織和細(xì)胞的再生。半月板由多種結(jié)締組織細(xì)胞構(gòu)成，包括外側(cè)富含I型膠原基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞，以及內(nèi)側(cè)富含硫酸糖胺聚糖（GAG）和II型膠原基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞組成。中部部位含有纖維軟骨細(xì)胞，既分泌I型膠原也分泌II型膠原。前期的研究表明，利用單細(xì)胞難以實(shí)現(xiàn)包含復(fù)雜細(xì)胞群的半月板組織再生。此外，除了外側(cè)，半月板的內(nèi)側(cè)與中部缺乏血供的問題也為半月板的修復(fù)帶來了困難。

在這篇研究中，作者設(shè)計(jì)了一種三維打印技術(shù)，仿生半月板異質(zhì)結(jié)構(gòu)，在半月板外側(cè)與內(nèi)側(cè)兩個(gè)特定的區(qū)域緩釋兩種不同的生長因子，誘導(dǎo)兩個(gè)區(qū)域分泌不同的細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)半月的再生與修復(fù)。

結(jié)果與討論：
第一部分
rhCTGF和rhTGFβ3因子用于誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞成纖維軟骨分化

設(shè)計(jì)依次用rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子按照不同的順序處理MSCs細(xì)胞，然后研究細(xì)胞成纖維分化情況，主要檢測其中COL-I，COL-II和蛋白聚糖（AGC）的表達(dá)。結(jié)果表明rhCTGF促進(jìn)II型膠原和AGC的表達(dá)，而rhTGFβ3促進(jìn)I型膠原的表達(dá)。

圖1 （A）利用rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子依次處理MSCs細(xì)胞后的proCOL-I和proCOL-IIα的免疫熒光分析（C→T（rhCTGF處理 2周，然后rhTGFβ3處理2周），T→C（rhTGFβ3處理2周，然后rhCTGF處理 2周），C + T（rhCTGF和TGFβ3同時(shí)處理4周），C4（rhCTGF單獨(dú)處理4周）和T4（rhTGFβ3單獨(dú)處理4周））。

（B）至（D）為MSCs在經(jīng)過（A）步驟處理后細(xì)胞的COL-I，COL-II和AGC的相對mRNA表達(dá)分析。

第二部分
3D打印人半月板支架及體外表征

利用3D打印技術(shù)打印聚己內(nèi)酯（PCL）材料得到人體半月板形狀框架，然后將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球作為緩釋材料分別包裹rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子填充到3D打印半月板框架的外側(cè)與內(nèi)側(cè)，最終得到人半月板支架，此外，同樣打印不負(fù)載兩種因子的3D打印半月板支架（負(fù)載空白PLGA微球）作為對照組。體外緩釋實(shí)驗(yàn)表明兩種因子均有良好的緩釋行為。體外種植人滑膜MSCs細(xì)胞培養(yǎng)6周后，發(fā)現(xiàn)在支架的外側(cè)有大量I型膠原表達(dá)，而內(nèi)側(cè)有大量II型膠原表達(dá)，這與大鼠的半月板結(jié)構(gòu)一致。體外種植1:1混合成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)6周后，阿辛藍(lán)染色（觀察蛋白聚糖）、天狼星紅染色（觀察I和III型膠原蛋白）以及免疫熒光染色（觀察I型和II型膠原蛋白）均表明該人半月板支架的外側(cè)有較多I型膠原表達(dá)，內(nèi)側(cè)有較多II型膠原和蛋白聚糖表達(dá)，二者連接處有較為明顯的移行區(qū)界面，符合人體半月板結(jié)構(gòu)特征。

圖2 （A）3D打印人體半月板框架結(jié)構(gòu)。
（B）分別包裹rhCTGF和rhTGFβ3的PLGA微球（μS）被填充到3D打印半月板支架的框架內(nèi)，并粘附在PCL纖維表面。
（C）分別將CTGF（綠色，40kD）和TGFβ3（紅色，10kD）進(jìn)行熒光標(biāo)記，顯示兩種因子被分別負(fù)載在人半月板支架的外部與內(nèi)部區(qū)域。
（D）人半月板支架中的hCTGF和rhTGFβ3體外緩釋數(shù)據(jù)。
（E）支架在人滑膜MSCs細(xì)胞在支架上培養(yǎng)6周后，緩釋的rhCTGF和rhTGFβ3分別誘導(dǎo)細(xì)胞在特定區(qū)域表達(dá)I型和II型膠原，該結(jié)構(gòu)類似于大鼠半月板。
（F）在人半月板支架上體外種植1:1混合成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)6周后對應(yīng)阿辛藍(lán)染色、天狼星紅染色以及免疫熒光染色結(jié)果。

第三部分
3D打印羊半月板支架及體內(nèi)試驗(yàn)

根據(jù)羊尸體上的天然半月板三維模型數(shù)據(jù)，3D打印PCL半月板形狀支架，然后分別在內(nèi)外側(cè)負(fù)載rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子。得到羊半月板支架后進(jìn)行力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該支架有著較羊天然半月板更好的動態(tài)模量（E *），儲能模量（E'）和損耗模量（E“）。手術(shù)將其植入到羊內(nèi)側(cè)半月板部位。12周后取出，數(shù)碼照片和HE染色結(jié)果顯示股骨與脛骨髁上的關(guān)節(jié)軟骨幾乎沒有損傷（圖3）。再生半月板取出后分別進(jìn)行HE染色、天狼星紅染色和阿辛藍(lán)染色（圖4），結(jié)果表明相比于不負(fù)載因子的3D打印半月板支架，負(fù)載呈特定區(qū)域分布的兩種因子的3D打印半月板支架在經(jīng)過12周的修復(fù)后有著明顯更加接近于天然半月板的膠原纖維和軟骨基質(zhì)表達(dá)。具體是，實(shí)驗(yàn)組的外側(cè)有較多I型膠原表達(dá)，內(nèi)側(cè)有較多II型膠原和蛋白聚糖表達(dá)，符合羊天然半月板結(jié)構(gòu)特征。

圖3（A）羊半月板的三維掃描，重建以及3D打印獲得羊半月板支架。
（B）3D打印羊半月板支架與天然半月板的動態(tài)模量（E *），儲能模量（E'）和損耗模量（E“）對比。
（C）2-0 縫合線對支架和天然半月板外緣的縫合后拉拔強(qiáng)度。
（D）支架和天然半月板的摩擦系數(shù)。
（E）羊半月板內(nèi)側(cè)手術(shù)移植。
（F）手術(shù)12周后取出的數(shù)碼照片與HE染色結(jié)果。

圖4（A）羊天然半月板中膠原纖維和軟骨基質(zhì)的分布。
（B和C）體內(nèi)移植12周后，可釋放的rhCTGF和rhTGFβ3的實(shí)驗(yàn)組（B）與對照組（C）相比的特定區(qū)域組織學(xué)染色。 組織切片用H＆E，阿辛藍(lán)（AB）和天狼星紅（PR）染色。
（D）再生半月板外側(cè)，中部，內(nèi)側(cè)的HE染色結(jié)果。
（E）在體內(nèi)植入12周后，對照組與實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)染色的低倍率圖。

將移植12周后再生的羊半月板（對照組與實(shí)驗(yàn)組）和天然半月板分別分為外側(cè)，中部，內(nèi)側(cè)三個(gè)部分，并依次進(jìn)行應(yīng)力松弛試驗(yàn)力學(xué)測試，得到各組各個(gè)區(qū)域的瞬時(shí)模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系數(shù)（μ）力學(xué)數(shù)據(jù)。同時(shí)對三組進(jìn)行拉伸力學(xué)測試，得到楊氏模量、極限強(qiáng)度和極限應(yīng)變力學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在相關(guān)力學(xué)測試結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組的力學(xué)性能均好于對照組，且接近天然半月板組織。

圖5 移植12周后再生的羊半月板（對照組與實(shí)驗(yàn)組）和天然半月板在各個(gè)區(qū)域（外側(cè)，中部，內(nèi)側(cè)）的瞬時(shí)模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系數(shù)（μ）。
（B）三組的拉伸楊氏模量、極限強(qiáng)度和極限應(yīng)變數(shù)據(jù)。

總結(jié)：
1.作者提出天然半月板分為內(nèi)側(cè)和外側(cè)兩個(gè)結(jié)構(gòu)，而且這兩個(gè)部分的膠原纖維和軟骨基質(zhì)成分以及細(xì)胞類型不同，外側(cè)富含I型膠原基質(zhì)和成纖維細(xì)胞，內(nèi)側(cè)富含蛋白聚糖、II型膠原基質(zhì)和軟骨細(xì)胞。復(fù)雜的基質(zhì)成分和細(xì)胞組成成為當(dāng)前半月板再生的難題。

2. 作者通過設(shè)計(jì)體外誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞成纖維軟骨細(xì)胞分化，結(jié)果表明rhCTGF促進(jìn)II型膠原的表達(dá)，而rhTGFβ3促進(jìn)I型膠原的表達(dá)。這是該項(xiàng)研究的理論基礎(chǔ)。

3. 結(jié)合PLGA微球緩釋技術(shù)和3D打印技術(shù)，制備可以在不同區(qū)域分別緩釋rhCTGF和rhTGFβ3兩種生長因子的3D打印人半月板支架，并體外證明該支架可以誘導(dǎo)細(xì)胞在其外側(cè)表達(dá)I型膠原，內(nèi)側(cè)表達(dá)II型膠原和蛋白聚糖。

4. 構(gòu)建羊半月板缺損模型，并將3D打印羊半月板支架體內(nèi)移植。培養(yǎng)12周后發(fā)現(xiàn)相比于空白對照組，負(fù)載呈特定區(qū)域分布的兩種因子的3D打印半月板支架在經(jīng)過12周的修復(fù)后有著明顯更加接近于天然半月板的膠原纖維和軟骨基質(zhì)表達(dá)。同時(shí)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組支架移植后的結(jié)果更好，表明了該支架對半月板再生的應(yīng)用潛力。

來源：科研互助小分隊(duì)

參考文獻(xiàn)：
Lee C H, Rodeo S A, Fortier L A, et al. Protein-releasing polymeric scaffolds induce fibrochondrocytic differentiation of endogenous cells for knee meniscus regeneration in sheep[J]. Science Translational Medicine, 2014, 6(266):266ra171. （IF=16.796）

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