3D打印技術(shù)在進(jìn)化：3D梯度水凝膠提供人造細(xì)胞生態(tài)位

帶狀組織在軟骨結(jié)構(gòu)和功能上起著重要的作用，然而迄今為止開發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只能允許具有均勻生化和機(jī)械特征的軟骨再生。為了更好地還原組織結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于具有仿生梯度生態(tài)位特征的工程材料有巨大的需求，這些材料可以重現(xiàn)原生組織。為了解決這個(gè)關(guān)鍵的未滿足需求，據(jù)南極熊了解，近日，斯坦福工程師們成功地將軟骨樣細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞裝入3D水凝膠。

據(jù)悉，這是一種快速形成組織梯度水凝膠作為具有生化和物理特性可調(diào)的3D細(xì)胞生態(tài)位方式。當(dāng)密閉在硬度梯度水凝膠中時(shí)，軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都顯示出帶狀特異性的反應(yīng)和細(xì)胞外沉積，這可模擬了關(guān)節(jié)軟骨組織的區(qū)域構(gòu)成。使用blebbistatin阻斷細(xì)胞機(jī)械感應(yīng)消除了具有硬度梯度的3D水凝膠中的軟骨細(xì)胞帶狀區(qū)反應(yīng)。這樣的組織大小的梯度水凝膠可以提供3D人造細(xì)胞生態(tài)位，從而使各種組織類型能夠打印帶狀結(jié)構(gòu)或者組織接觸面。

盡管帶狀結(jié)構(gòu)在軟骨結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，但迄今研發(fā)的大多數(shù)組織工程策略只允許具有均勻的生化和機(jī)械特征的軟骨再生。軟骨損傷是極為常見的，但是由于軟骨的弱細(xì)胞性和無血管的特性，軟骨具備有限的自愈能力。由于關(guān)節(jié)軟骨從淺表層轉(zhuǎn)移到深層，軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的硬度開始增加，ECM的成分如葡糖氨基葡聚糖的含量增加，以及肥厚性軟骨標(biāo)志物如X型膠原蛋白含量增加。
研發(fā)了各種策略進(jìn)行具有梯度信號(hào)的生物材料的制備，并作為細(xì)胞的生態(tài)位，例如靜電紡絲，模塊化水凝膠體系，激光掃描光刻，對(duì)流擴(kuò)散，微流體以及融合預(yù)制化微球。然而，這些策略中的絕大部分通常需要冗長(zhǎng)的制造過程或者使用非細(xì)胞友好性的試劑，這不能夠保證可通過均勻方式進(jìn)行細(xì)胞封存的組織標(biāo)尺的梯度生物材料的制造。因此，在三維空間中，梯度生態(tài)位置如何影響細(xì)胞介導(dǎo)的組織形成，在很大程度上尚未可知。此外，雖然最近的研究在針對(duì)力學(xué)信號(hào)（如基質(zhì)的硬度）在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞命運(yùn)（包括細(xì)胞的增殖和分化）的作用上取得了突破，但是激活或者阻斷機(jī)械感應(yīng)如何影響3D組織中細(xì)胞命運(yùn)和ECM的形成仍有待研究。

來源：Tissue Engineering

為了將帶狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為工程軟骨，一種策略是將軟骨細(xì)胞進(jìn)行模式分類，從有不同區(qū)域帶狀特異性表型的軟骨細(xì)胞，到不同層化的軟骨細(xì)胞。利用連續(xù)的光聚合，多層水凝膠可以從不同的區(qū)域中被分離出來，并被封裝在不同的層中，以更好地模擬體內(nèi)帶狀結(jié)構(gòu)。另一種策略是利用單一的細(xì)胞來源，利用多層的水凝膠，利用不同的生化和機(jī)械性能，進(jìn)行基質(zhì)特征的模式歸類。

在介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)和組織形成方面，生物化學(xué)和物理的特征都發(fā)揮了重要作用。間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和一種被包裹在多層支架上的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出帶狀特異性的分化，這些多層支架具有空間變化的基質(zhì)組分和機(jī)械特征。雖然上述的策略已經(jīng)改善了用均勻的水凝膠獲得的工程軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)，但獲得的組織顯示出了獨(dú)特的層，而原生軟骨則以連續(xù)的梯度方式過渡。此外，由于界面上的水凝膠硬度的不連續(xù)性，層間界面往往是脆弱的，容易受到機(jī)械應(yīng)力的影響下分離。

與多層水凝膠相反，仿生梯度水凝膠在生物化學(xué)和/或機(jī)械特征上具有連續(xù)的變化，從而在在體內(nèi)可更精確的模擬組織連接和帶狀結(jié)構(gòu)形成。為了來更好地模擬骨和軟骨接觸面，進(jìn)行MSCs在3D空間中的帶狀特異性分化的誘導(dǎo)，容納可溶性因子梯度的水凝膠通過含有不同梯度的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）和胰島素生長(zhǎng)因子（rhIGF-1）的微球體所制造出來。

另外，還制備了不同基質(zhì)硬度的水凝膠，并使用發(fā)育信號(hào)誘導(dǎo)區(qū)域依賴性的MSC分化。還使用具有生物化學(xué)特征的聚丙烯酰胺（PAAM）水凝膠來制備含有不溶性基質(zhì)梯度（例如,硬度）的水凝膠。此外，還開發(fā)了一種基于微流體的方法，制備雙梯度聚乙二醇(PEG)水凝膠，其包含了化學(xué)和物理梯度，但這種微尺度平臺(tái)不適合用于臨床空間上制造組織大小的梯度水凝膠。

雖然細(xì)胞在體內(nèi)的3D生態(tài)位存留，但以前的報(bào)告主要局限于2D研究，這是因?yàn)樵诮M織規(guī)模的三維梯度水凝膠中以快速和細(xì)胞友好的方式封裝細(xì)胞是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。因此，仍然迫切需求開發(fā)一種生物材料平臺(tái)，通過這個(gè)平臺(tái)可以對(duì)在3D中的組織梯度水凝膠中的細(xì)胞進(jìn)行研究。目前研究的目的是開發(fā)一種細(xì)胞兼容性好的方法，用于制造組織大小的梯度水凝膠作為3D細(xì)胞特征，從而指導(dǎo)帶狀結(jié)構(gòu)的軟骨再生。

我們假設(shè)具有硬度梯度的水凝膠將會(huì)誘導(dǎo)封存細(xì)胞在3D空間中產(chǎn)生帶狀特異性反應(yīng)，并且通過梯度水凝膠中新沉積的組織來模擬本身關(guān)節(jié)軟骨的帶狀結(jié)構(gòu)。為了測(cè)試這個(gè)假設(shè)，將新生的牛軟骨細(xì)胞或者人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密閉在3D梯度水凝膠中7或21天。使用機(jī)械測(cè)定、定量基因表達(dá)、生化檢驗(yàn)和組織學(xué)來評(píng)價(jià)梯度水凝膠中新形成組織的情況。

來源：科學(xué)橋研究院