Nature子刊：光固化絲素蛋白墨水生物3D打印

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投影式光固化3D打�。―LP）是一種通過(guò)光激發(fā)，分層固化的3D打印技術(shù)，具有高分辨率、可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)精細(xì)打印的特點(diǎn)。與擠出式3D打印不同，DLP為無(wú)噴嘴打印，其過(guò)程不會(huì)對(duì)生物墨水中的細(xì)胞產(chǎn)生大剪切力，因此可獲得較高的細(xì)胞存活率。在DLP打印過(guò)程中，雖然可以通過(guò)調(diào)控光強(qiáng)、曝光時(shí)間、引發(fā)劑類型和濃度等來(lái)調(diào)節(jié)固化動(dòng)力學(xué)。但是，生物材料自身特性才是DLP生物墨水可打印性的決定因素。

來(lái)自韓國(guó)哈林大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Chan Hum Park和美國(guó)威克森林醫(yī)學(xué)院的Sang Jin Lee團(tuán)隊(duì)首次合成了一種光固化生物墨水材料:甲基丙烯酸縮水甘油酯改性絲素蛋白（Sil-MA）。研究發(fā)現(xiàn)，Sil-MA具有優(yōu)秀的載細(xì)胞DLP打印性能、良好的成軟骨能力及與天然軟骨相匹配的機(jī)械性能。相應(yīng)研究成果分別發(fā)表于期刊Nature Communications和Biomaterials上。

圖1. Sil-MA合成原理及其制備過(guò)程示意圖[1]。

絲素蛋白（SF）來(lái)源于蠶絲的脫膠處理，具有良好的生物相容性、可生物降解性、高拉伸強(qiáng)度等特點(diǎn)，已被用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括傷口敷料、人造血管、細(xì)胞培養(yǎng)等。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）對(duì)SF進(jìn)行甲基丙烯化改性，在SF分子上引入雙鍵。由于SF分子特殊的空間結(jié)構(gòu)，其在改性前極易形成結(jié)晶而難溶于水。由于引入額外的化學(xué)基團(tuán)，SF-MA分子不易結(jié)晶，可在水中溶解，這使SF-MA可形成光固化水凝膠。

圖1. Sil-MA墨水DLP打印示意圖及不同濃度Sil-MA光固化水凝膠壓縮、拉伸性能[1]。

在進(jìn)行DLP打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)前，該團(tuán)隊(duì)研究了不同濃度DLP打印Sil-MA光固化水凝膠的機(jī)械性能。研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)紫外光強(qiáng)為3.5 mW/cm2時(shí)，每一層溶液的固化時(shí)間小于3s，這有利于提高打印速率。打印水凝膠的壓縮模量隨Sil-MA濃度和應(yīng)變的增加而增加。Sil-MA濃度每增加10％，壓縮模量就會(huì)增加約2.6倍（圖1 b、c）。對(duì)于濃度30％的Sil-MA水凝膠，壓縮破壞應(yīng)力高達(dá)910 kPa，其足以支撐重達(dá)7 kg的壺鈴，并在壺鈴取下后立即恢復(fù)其原始形狀（圖1 d）。Sil-MA水凝膠水凝膠同樣具有很高的拉伸強(qiáng)度，濃度為30％時(shí)，其拉伸斷裂應(yīng)力可達(dá)50 kPa。Sil-MA水凝膠優(yōu)良的機(jī)械性能使其可經(jīng)受簡(jiǎn)單的外科縫合而不撕裂（圖1 g、h）。

圖2. 30% Sil-MA多孔結(jié)構(gòu)DLP打印分辨率測(cè)試[1]

圖3. 30% Sil-MA墨水通過(guò)DLP技術(shù)打印的微孔支架及埃菲爾鐵塔模型[1]

隨后，研究人員測(cè)試了Sil-MA墨水的DLP打印分辨率及復(fù)雜結(jié)構(gòu)成型能力。從圖2孔道結(jié)構(gòu)水平和垂直方向打印測(cè)試可以看出，垂直孔道可實(shí)現(xiàn)約100μm的打印精度，水平孔道可實(shí)現(xiàn)約200 μm的打印精度。研究人員利用Sil-MA墨水分別打印了多孔三維支架和埃菲爾鐵塔模型（圖3），從實(shí)物圖可看出：孔道直徑700μm及1mm的多孔支架貫通性良好，高度5cm的埃菲爾鐵塔模型具有規(guī)整的外形。

圖4. 與GelMA相比，不同濃度Sil-MA水凝膠內(nèi)3T3成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及增值情況（a、b，標(biāo)尺500 μm），載細(xì)胞DLP打印不同結(jié)構(gòu)水凝膠及其內(nèi)部細(xì)胞分布圖（c~f，標(biāo)尺5 mm）[1]。

以水凝膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)三維培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞的存活及增值是評(píng)價(jià)生物墨水性能的重要指標(biāo)，研究者將濃度為10、20、30%的Sil-MA與已知具有優(yōu)異生物性能的甲基丙烯�；�明膠（GelMA）作對(duì)比。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sil-MA水凝膠中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且濃度30%Sil-MA凝膠中細(xì)胞的增殖能力與10% GelMA對(duì)照組基本相同（圖4a、b）。

載細(xì)胞DLP打印最大的技術(shù)挑戰(zhàn)是墨水中細(xì)胞的沉降，這造成細(xì)胞無(wú)法在支架中均勻分布。在后續(xù)的載細(xì)胞打印實(shí)驗(yàn)中，研究人員測(cè)試了Sil-MA不同形狀樣品及多細(xì)胞分區(qū)打印性能（圖4c~f）。從激光共聚焦掃描結(jié)果看，細(xì)胞較為均勻的分布于打印支架中，無(wú)明顯分層。圖4f展示了一個(gè)具有四層結(jié)構(gòu)、兩種顏色標(biāo)記細(xì)胞的DLP打印支架。

圖5. 負(fù)載人軟骨細(xì)胞的Sil-MA水凝膠DLP打印及體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過(guò)程[2]。

經(jīng)過(guò)材料合成、機(jī)械性能、打印性能、生物相容性等研究后，該團(tuán)隊(duì)又進(jìn)行了更深層次的體內(nèi)外生物學(xué)評(píng)價(jià)-軟骨組織工程。

圖6. 載鼠NIH 3T3成纖維細(xì)胞DLP打印Sil-MA支架縱剖面細(xì)胞分布染色圖（A，比例尺：1 mm），細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)（B）[2]。

研究人員將DLP打印的載有NIH 3T3成纖維細(xì)胞Sil-MA支架在體外培養(yǎng)，并在0、4、7天對(duì)支架進(jìn)行切片染色觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖6所示。熒光照片顯示細(xì)胞在支架的上部與下部分布均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示同樣的結(jié)果，且培養(yǎng)第7天細(xì)胞有增值的趨勢(shì)。

圖7. 兔氣管、純Gel-GMA、純Sil-MA、載軟骨細(xì)胞Sil-MA水凝膠支架在不同體外培養(yǎng)時(shí)間后的三點(diǎn)彎曲測(cè)試數(shù)據(jù)[2]。

為了確定人工氣管的機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)體外培養(yǎng)1-2周的純GMA改性的明膠（Gel-GMA）、純Sil-MA、載軟骨細(xì)胞Sil-MA水凝膠進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測(cè)試，以天然兔氣管作為對(duì)照，結(jié)果如圖7所示。體外培養(yǎng)1周和2周后不含細(xì)胞的Gel-GMA水凝膠強(qiáng)度比天然兔氣管弱，不含細(xì)胞的Sil-MA表現(xiàn)出同樣結(jié)果。但是不含細(xì)胞Sil-MA水凝膠的強(qiáng)度取決于體外培養(yǎng)的時(shí)間。此外， Sil-MA水凝膠在負(fù)載細(xì)胞后表現(xiàn)出更高的強(qiáng)度，且隨培養(yǎng)時(shí)間增加。載細(xì)胞的Sil-MA水凝膠在體外培養(yǎng)后具有與天然兔氣管相似的強(qiáng)度。

圖8. 負(fù)載人軟骨細(xì)胞Sil-MA水凝膠體外培養(yǎng)后切片染色圖及硫酸糖胺多糖（sGAG）含量、相應(yīng)軟骨細(xì)胞特異性基因凝膠電泳圖[2]。

對(duì)體外培養(yǎng)的載軟骨細(xì)胞Sil-MA水凝膠進(jìn)行組織切片蘇木精和曙紅（H＆E），馬森三色（MT），番紅O（SFO）和PKH67染色（圖8）。在培養(yǎng)的第一周，Sil-MA水凝膠中出即現(xiàn)了軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形成了新軟骨，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量及生成的軟骨量持續(xù)增加。切片染色結(jié)果顯示Sil-MA水凝膠可為軟骨細(xì)胞提供良好的的生長(zhǎng)和成軟骨環(huán)境。圖8中軟骨細(xì)胞分泌的糖胺多糖及軟骨細(xì)胞相應(yīng)基因?qū)W水平測(cè)試結(jié)果同樣表明，Sil-MA水凝膠可為軟骨基質(zhì)的生成提供有利條件。

圖9. 載軟骨細(xì)胞DLP打印支架植入兔氣管實(shí)驗(yàn)圖及植入6周后的組織切片圖[2]。

最后，研究人員將DLP打印的載軟骨細(xì)胞支架體外培養(yǎng)一周后縫合到兔氣管缺損處（圖9）。初期，Sil-MA水凝膠與周圍組織不夠吻合，使腔體變窄。隨著移植期延長(zhǎng)，周圍組織長(zhǎng)入手術(shù)部位，使凝膠成為氣管的一部分，氣管內(nèi)徑逐漸增加。移植后第6周進(jìn)行H＆E和MT染色，結(jié)果顯示在Sil-MA水凝膠內(nèi)形成了新的軟骨。此外，Sil-MA水凝膠周圍發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)展的上皮基質(zhì)。人工氣管的移植結(jié)果表明，Sil-MA水凝膠替代了氣管的缺損部分，并引導(dǎo)了氣管的再生。

參考文獻(xiàn)：
[1]   Kim SH, Yeon YK, Lee JM, et al. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing [J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 1–14. DOI: 10.1038/s41467-018-03759-y
[2]   Hong H, Seo YB, Kim DY, et al. Digital light processing 3D printed silk fibroin hydrogel for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials, 2020, 232: 119679. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119679