3D打印微針陣列貼片可用于小分子、蛋白質(zhì)和核酸等液態(tài)固態(tài)皮內(nèi)給藥

來源： EFL生物3D打印與生物制造

自20世紀(jì)70年代以來，微針陣列貼片(MAP)一直是微創(chuàng)藥物輸送和診斷的有前途的平臺。傳統(tǒng)上，MAP由放置在聚合物背襯上的均勻分布的微米級針頭陣列組成。這些微針可以刺穿角質(zhì)層，進(jìn)入皮膚的表皮層和真皮層，而不會到達(dá)神經(jīng)，從而實現(xiàn)無痛的皮內(nèi)(ID)治療。近日，來自斯坦福大學(xué)的Joseph M. DeSimone/北卡羅來納大學(xué)的Jillian L. Perry團(tuán)隊利用高分辨率3D打印制備了一種新型格狀MAP (L-MAP)結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)模制和固體涂層MAP相比，L-MAP可以用每個貼片更少的針頭裝載更多貨物，從而增強貨物裝載和藥物輸送能力。此外，L-MAP可以成為相關(guān)治療貨物（小分子、蛋白質(zhì)和核酸）的液態(tài)和固態(tài)輸送的平臺技術(shù)。

相關(guān)研究成果以“3D-Printed Latticed Microneedle Array Patches for Tunable and Versatile Intradermal Delivery”為題于2024年9月2日發(fā)表在《Advanced Materials》上。

1.網(wǎng)格微針陣列貼片(L-MAP)庫的系統(tǒng)設(shè)計
為了設(shè)計L-MAP，系統(tǒng)地改變了針基形狀（三角形、正方形、五邊形、六邊形和圓形）、針中格子層數(shù)（1、2和3）以及支柱的錐形尺度等變量（圖1A）。錐形尺度是指每個支撐支柱從基部到尖端的錐形程度，如圖1A所示，錐形尺度越大，最小支柱寬度和最大支柱寬度之間的差異就越大。這三個關(guān)鍵變量的組合用于生成不同L-MAP設(shè)計組。使用這種設(shè)計策略，生成了43個L-MAP設(shè)計，并從計算機輔助設(shè)計(CAD)文件中計算出空隙體積和支柱表面積（圖1B）。該策略用于探索一系列針頭表面積和空隙體積，以分離具有不同貨物釋放動力學(xué)的設(shè)計。   

為了設(shè)計機械完整性（MI）評分，將針頭體積中具有高安全系數(shù) (>6) 的百分比最大化，同時將其預(yù)測的最大von Mises應(yīng)力(GPa)和尖端變形最小化。使用5個樣本L-MAP設(shè)計驗證了開發(fā)的MI評分系統(tǒng)，并根據(jù)MI評分以經(jīng)驗方式評估了它們的抗壓強度。有三種L-MAP設(shè)計的MI評分高于10，而其他設(shè)計的MI評分則低一個數(shù)量級(圖1C)。根據(jù)庫設(shè)計和計算機模擬的數(shù)據(jù)，選擇了最佳L-MAP設(shè)計，以便根據(jù)圖1D中概述的工作流程進(jìn)行下游表征并與方形底座實心針狀MAP進(jìn)行比較。

圖1 生成L-MAP設(shè)計庫

2.L-MAP設(shè)計的制造和機械特性
隨后，作者對三種下選的L-MAP設(shè)計進(jìn)行了優(yōu)化，以便在Carbon 3D開發(fā)的工業(yè)化高分辨率CLIP原型打印機上進(jìn)行打印。該研究成功在10分鐘內(nèi)打印出每個補丁的L-MAP（打印尺寸= 5 mm × 8.2 mm × 2 mm），并拍攝了針頭的SEM圖像以顯示針頭的形態(tài)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖2B）。每片貼片有40根針頭的L-MAP設(shè)計在Instron裝置上進(jìn)行了壓縮測試，以評估失效力和失效模式（圖2C）。所有針頭均因屈曲而非斷裂而失效，這對于避免殘留針頭碎片留在用戶皮膚中的危險非常理想。所有這些失效力均大于每根針∼0.1 N，這是穿透皮膚所需的平均力（圖2D）。使用光學(xué)相干斷層掃描(OCT)評估L-MAP在切除的人體皮膚中的穿透深度（圖2E）�？傮w而言，與實心MAP 相比，這三種L-MAP設(shè)計在人體皮膚中的平均穿透深度都更高（圖2Eii）。  

圖2 最佳L-MAP設(shè)計的3D打印和機械特性

3.L-MAP的固態(tài)和液態(tài)小分子輸送
為了證明該平臺在小分子固態(tài)和液態(tài)輸送中的實用性，作者選擇了亞甲藍(lán)染料作為模型貨物。對于固態(tài)貨物裝載，將貼片浸涂在 0.5 wt/v% 亞甲藍(lán)染料和粘度/穩(wěn)定性增強賦形劑（甲基纖維素和蔗糖）的混合物中。浸涂后，將貼片在室溫下風(fēng)干1小時（圖3Ai）。一般而言，與尺寸相似的固體MAP相比，L-MAP的貨物裝載量至少增加了2倍，其中Sq 2 Tier L-MAP設(shè)計可容納最多的貨物（圖3Aii）。固態(tài)貨物裝載量也可以通過增加MAP浸涂層的數(shù)量來增加。此外，L-MAP設(shè)計的貨物裝載在第三次浸涂后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。因此，對于后續(xù)的固態(tài)貨物輸送特性，所有MAP每個貼片都進(jìn)行了3次浸涂。對于液體輸送，使用類似的浸涂策略，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中將0.5 wt/v% 亞甲藍(lán)染料裝入貼片，并量化裝載的液體染料量（圖3B）。從光學(xué)顯微鏡圖像中可以看出，L-MAP能夠?qū)⒁后w貨物的液滴截留在空隙中，而固體MAP則無法捕獲任何液體制劑（圖3Bi）。  

在水合的、切除的豬皮中評估了每種L-MAP設(shè)計的小分子染料輸送動力學(xué)。貼片上裝有0.5 wt/v% 亞甲藍(lán)染料（固態(tài)或液態(tài)），并在指定的應(yīng)用時間內(nèi)應(yīng)用于豬耳皮膚活檢。取下貼片后，獲得了輸送到皮膚的染料量，相對于貼片上剩余貨物的百分比。該方法用于評估固態(tài)（圖3C）和液態(tài)（圖3D）小分子制劑的貨物輸送動力學(xué)。考慮到液體貨物的運送，僅評估了L-MAP的釋放曲線，因為液體貨物無法被固體MAP有效捕獲。正如預(yù)期的那樣，固態(tài)運送的釋放動力學(xué)與液態(tài)不同（圖3C、D）。對于固態(tài)貨物運送，Pent 2 Tier和Sq 3 Tier設(shè)計似乎具有相似的釋放動力學(xué)，45%的貨物在5分鐘內(nèi)釋放。Sq 2 Tier設(shè)計似乎以稍慢的方式釋放貨物，5分鐘內(nèi)只有38%的貨物運送。最后，固體MAP釋放貨物最快，5分鐘內(nèi)貨物運送率為56%。

此外，作者還觀察到液體貨物的釋放動力學(xué)隨L-MAP設(shè)計的不同而不同，其中Sq 2 Tier 貼片可提供最快、最高效的貨物輸送。超過85%的貨物在5分鐘的應(yīng)用時間內(nèi)輸送（圖3D）。綜合以上數(shù)據(jù)可知LMAP可用于將固態(tài)和液態(tài)小分子有效載荷有效地輸送到皮膚，具有不同的釋放曲線。   

圖3 固態(tài)和液態(tài)、小分子染料輸送的動力學(xué)

4.使用L-MAP進(jìn)行固態(tài)卵清蛋白(OVA)輸送
蛋白質(zhì)抗原遞送在疫苗領(lǐng)域備受關(guān)注，并且已經(jīng)證明卵清蛋白(OVA)通過MAP遞送是一種有前途的蛋白質(zhì)抗原和蛋白質(zhì)治療替代品。因此，作者選擇使用之前報道過的固態(tài)OVA蛋白配方，通過L-MAP展示可調(diào)節(jié)的釋放動力學(xué)（圖4A-B）。為了展示不同的釋放曲線，選擇了用不同熒光團(tuán)（Texas Red 和 AlexaFluor 488）標(biāo)記的OVA蛋白。首先，在切除的豬皮中評估了每片貼片一個針頭設(shè)計L-MAP（Sq 2 Tier 或 Pent 2 Tier）的釋放曲線。使用SEM和熒光顯微鏡驗證分離的Texas Red標(biāo)記OVA在 Sq 2 Tier針頭上的裝載情況和AlexaFluor 488標(biāo)記OVA在Pent 2 Tier針頭上的裝載情況（圖4C）。在離體豬皮中證實了單個貼片觀察到的趨勢，其中Sq 2 Tier幾何形狀再次比混合L-MAP上的Pent 2 Tier幾何形狀釋放貨物的速度更快（圖4Di）。去除貼片后，用膠帶剝離皮膚，以量化L-MAP部署期間沉積在皮膚表面的貨物量。再次觀察到，皮膚表面沉積的貨物量極少（<4%），時間點之間沒有顯著差異（圖4Dii）。通過切片組織進(jìn)一步驗證了這些結(jié)果，以可視化每個熒光團(tuán)標(biāo)記的OVA蛋白的熒光信號深度。   

驗證了不同的釋放動力學(xué)曲線后，將混合L-MAP應(yīng)用于大鼠，時間為10 分鐘、30分鐘、1小時或4小時（圖4Ei）。一般來說，熒光信號可持續(xù)長達(dá)24小時，大多數(shù)信號在移除貼片后48小時消失（圖4Eiii）。與Pent 2 Tier部分相比，混合L-MAP的Sq 2 Tier部分還在更短的時間內(nèi)釋放了更高百分比的OVA貨物，這進(jìn)一步證實了在離體豬皮中觀察到的結(jié)果（圖4Di）。以上數(shù)據(jù)表明混合L-MAP可以實現(xiàn)同一類型貨物的不同釋放曲線，并且L-MAP 系統(tǒng)可用于遞送固態(tài)OVA蛋白。

圖4 L-MAP OVA蛋白質(zhì)輸送具有不同的釋放動力學(xué)

5.使用L-MAP進(jìn)行液態(tài)mRNA遞送
隨著COVID mRNA疫苗的推出，液態(tài)mRNA疫苗在疫苗遞送領(lǐng)域也獲得了關(guān)注。為了證明L-MAP平臺在體內(nèi)皮內(nèi)液體遞送中的實用性，作者選擇了封裝在D-Lin MC3脂質(zhì)納米顆粒(LNP)中的螢火蟲熒光素酶(FLuc)mRNA作為治療相關(guān)的模型貨物。Sq 2 Tier 設(shè)計被選為RNA遞送，因為它具有高空隙率和液態(tài)遞送的快速釋放特性（圖3D）。40針Sq 2 Tier L-MAP每貼片可裝載約850 ng FLuc mRNA，每針可裝載20 ng（圖5A）。這種RNA裝載能力與傳統(tǒng)的可溶解和涂層MAP系統(tǒng)相當(dāng)，但每貼片所需的針頭數(shù)量大約是后者的一半（圖5B）。

為了證明可重復(fù)的RNA遞送和轉(zhuǎn)染，作者采用了活體切除豬皮膚模型證明了Sq 2 Tier L-MAP可以遞送貨物并引發(fā)局部細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在短短1分鐘的應(yīng)用時間內(nèi)就觀察到了FLuc蛋白表達(dá)（圖 5Ci）。此外，遞送了兩劑量的mRNA，分別為0.4 μg和0.8 μg，并顯示出L-MAP的劑量依賴性。無論貼劑應(yīng)用時間長短，從較高RNA劑量觀察到的發(fā)光信號始終高于較低劑量的發(fā)光信號（圖5Cii）。這表明，只需改變裝載溶液中貨物的濃度即可控制遞送劑量。然后通過L-MAP將FLuc mRNA LNPs注入活體動物體內(nèi)。將載有液體mRNA LNP 的L-MAPs應(yīng)用于大鼠5分鐘或1小時，并使用空貼片作為陰性對照（圖5Di）。通過評估貼片上剩余的RNA，確定在短短5分鐘的應(yīng)用時間內(nèi)，大約50%的裝載液體貨物已經(jīng)釋放（圖5Dii）。在更長的應(yīng)用時間（1小時）實現(xiàn)了75%的貨物輸送。與現(xiàn)有的 RNA MAP 系統(tǒng)相比，輸送效率大約高出兩倍。

此外，在所有使用液體FLuc mRNA 輸送的Sq 2 Tier L-MAP中都觀察到了穩(wěn)健的轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖5Diii）。早在去除貼片后3小時就觀察到發(fā)光信號，去除L-MAP后24小時達(dá)到峰值，72小時減弱，顯示出典型的mRNA組織轉(zhuǎn)染特征（圖5Div）。通過這些結(jié)果，證明了L-MAP液體RNA在大鼠中的高效和可重復(fù)性遞送，并因此實現(xiàn)了強勁的蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖5 Sq 2 Tier L-MAP可運送液體RNA貨物并轉(zhuǎn)染細(xì)胞

在這項工作中，作者利用高分辨率打印機來擴(kuò)展L-MAP的多功能性和可調(diào)性，并運送大量固態(tài)和液態(tài)貨物。所設(shè)計的新型L-MAP結(jié)構(gòu)帶有錐形支柱，可以幫助保持更大的空隙體積，同時在晶格針頭內(nèi)提供機械完整性。此外，L-MAP可以成為相關(guān)治療貨物（小分子、蛋白質(zhì)和核酸）的液態(tài)和固態(tài)輸送的平臺技術(shù)。這項工作有望將藥物輸送（尤其是多種有效載荷的輸送）擴(kuò)展到皮內(nèi)空間。L-MAP平臺引入的模塊化為多種有效載荷開辟了藥物遞送方案。然而，一個潛在的限制是確保在更短的佩戴時間內(nèi)實現(xiàn)更高的遞送效率。希望通過整合可以產(chǎn)生快速、高效遞送方案的設(shè)備設(shè)計元素，擴(kuò)展這項工作，以在未來的研究中展示L-MAP的治療潛力。

文章來源：

https://doi.org/10.1002/adma.202404606