三維打印在軟骨組織工程中的應(yīng)用

作者：于淑穎 李昱 程新好 張怡君 劉錚 閆成祥 謝百慧 王喜梅
來(lái)源：《中華整形外科雜志》2024年01月 第40卷 第01期
作者單位：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科， 鄭州450000
通信作者：王喜梅，Email:tracywang@zzu.edu.cn

在過(guò)去的幾十年中，軟骨的再生已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展。傳統(tǒng)構(gòu)建組織工程軟骨支架的技術(shù)主要包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發(fā)泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等。軟骨是異質(zhì)性的，傳統(tǒng)支架很難模擬軟骨的高度各向異性結(jié)構(gòu)。因此，軟骨的功能再生具有挑戰(zhàn)性。隨著三維打印技術(shù)的進(jìn)步，通過(guò)生物材料、細(xì)胞和活性生物分子的共沉積，使制備精細(xì)結(jié)構(gòu)、梯度變化的功能性仿生支架成為可能，從而實(shí)現(xiàn)功能性軟骨再生。該文詳細(xì)闡述了三維打印技術(shù)及其在不同解剖位置(關(guān)節(jié)、耳廓、鼻)軟骨再生中的應(yīng)用。此外，還討論了制備具有區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度和區(qū)域成分梯度的仿生構(gòu)建體的重要性。三維生物打印、四維打印技術(shù)及智能材料為仿生組織和器官的構(gòu)建帶來(lái)了希望。

軟骨組織工程是集材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科的研究領(lǐng)域，隨著材料科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及三維打印技術(shù)等的不斷進(jìn)步，近幾十年來(lái)軟骨組織工程也得到了飛速的發(fā)展 [ 1 ]。軟骨組織工程包括支架、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子3個(gè)經(jīng)典要素 [ 2 ]，該技術(shù)主要是利用自體軟骨細(xì)胞或成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，將種子細(xì)胞接種在具有三維多孔結(jié)構(gòu)的生物可降解支架材料上，種子細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的指導(dǎo)作用下，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)姆只�調(diào)節(jié)，形成軟骨或軟骨樣組織 [ 3 ]。軟骨支架為種子細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖提供支撐作用，也為軟骨及軟骨樣組織的再生和重建提供有利空間，在軟骨組織工程中占據(jù)至關(guān)重要的位置。理想的軟骨組織工程支架材料應(yīng)具有以下幾個(gè)特性：(1)生物相容性，支持種植于其上的種子細(xì)胞增殖、分化、成熟；(2)可降解性，支架置入后隨著時(shí)間的推移可以緩慢降解，并促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生新的軟骨基質(zhì)取代支架材料，以便再生軟骨組織將其取代 [ 4 ]；(3)生物力學(xué)性能，能穩(wěn)定維持軟骨的形狀，具有與要修復(fù)軟骨組織一致的機(jī)械性能；(4)個(gè)性化，支架的外形應(yīng)當(dāng)與修復(fù)區(qū)域匹配，或易于被塑造成各種所需的形狀；(5)適當(dāng)?shù)目紫堵�，允許分子、營(yíng)養(yǎng)物和氧氣的遷移和擴(kuò)散 [ 5 ]。

傳統(tǒng)的軟骨支架制備方法包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發(fā)泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著難以靈活設(shè)計(jì)和精確調(diào)控支架的微觀結(jié)構(gòu)、難以個(gè)性化制造與損傷部位高度契合的支架外形、難以構(gòu)建非均勻特征的支架(雙相及多相支架)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，三維打印技術(shù)發(fā)展迅速，在計(jì)算機(jī)輔助成型的基礎(chǔ)上能夠精準(zhǔn)構(gòu)建和調(diào)控支架的宏觀外形與微觀特征，形成具有良好相容性、形態(tài)和力學(xué)強(qiáng)度適宜的軟骨仿生梯度支架，最終達(dá)成軟骨及軟骨樣組織的個(gè)性化修復(fù)與再生 [ 6 , 7 ]。因此，三維打印技術(shù)在軟骨組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用有著廣闊的發(fā)展前景。本文詳細(xì)介紹了軟骨組織工程的種子細(xì)胞、支架材料、三維打印技術(shù)，以及三維打印技術(shù)在不同解剖位置(關(guān)節(jié)軟骨、耳廓、鼻)軟骨再生中的應(yīng)用。此外，還討論了具有區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度和區(qū)域成分梯度的仿生構(gòu)建體的制備方法，三維生物打印技術(shù)、四維打印、智能材料為仿生組織和器官的構(gòu)建帶來(lái)了希望。

一、三維打印技術(shù)
(一)三維打印技術(shù)的幾種方式
三維打印技術(shù)是一種快速成型技術(shù)，又稱增材制造，是以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，運(yùn)用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過(guò)逐層打印的方式來(lái)構(gòu)造物體的技術(shù) [ 1 ]。通過(guò)結(jié)合CT、MRI、表面掃描和三維攝影等成像技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(computer-aided design，CAD)和計(jì)算機(jī)輔助制造(computer-aided manufacturing，CAM)技術(shù)，將目標(biāo)軟骨形狀數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為三維打印數(shù)字模型文件，再經(jīng)由三維打印技術(shù)精確定制軟骨結(jié)構(gòu)外形，獲得理想的組織工程軟骨。常見(jiàn)的三維打印方式包括：熔融沉積技術(shù)(fused deposition modeling, FDM)、立體光刻法、低溫沉積制造(low-temperature deposition modeling, LDM)、選擇性激光燒結(jié)(selective laser sintering, SLS)、三維打印成型(three-dimensional printing, 3DP)、電子束自由成型制造(electron beam freeform fabrication, EBF)、直接金屬激光燒結(jié)(direct metal laser sintering, DMLS)、電子束熔化成型(electron beam melting, EBM)、選擇性激光熔化成型( selective laser melting, SLM)、選擇性熱燒結(jié)(selective heat sintering, SHS)等 [ 8 , 9 ]。下面主要介紹FDM、立體光刻法、LDM及SLS。

1．FDM
FDM是最常用的三維打印技術(shù)。FDM原理是在計(jì)算機(jī)精準(zhǔn)控制路徑中，高溫熔融擠出聚合物材料流經(jīng)噴嘴后，材料在逐層打印過(guò)程中形成適當(dāng)?shù)男螤? 圖1 )。FDM可以快速制造具有高度互連的孔幾何結(jié)構(gòu)和通道尺寸的支架。通過(guò)改變擠出壓力、噴嘴直徑和沉積速度等工藝參數(shù)，可以打印具有寬范圍細(xì)絲直徑和孔隙率的支架。FDM通常適用于聚己內(nèi)酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸等熱塑性高分子的成型以及少數(shù)溫敏材料的打印，其特點(diǎn)是材料加工應(yīng)用靈活，打印的結(jié)構(gòu)精度高、支架力學(xué)強(qiáng)度較為理想，可構(gòu)建多種軟骨支架，在三維打印中廣泛應(yīng)用。但由于FDM加工溫度高，F(xiàn)DM的材料處于受熱狀態(tài)，細(xì)胞無(wú)法在打印過(guò)程存活，不適用于生物打印 [ 8 ]。

2．立體光刻法
立體光刻法包括光固化(stereolithography, SLA)和數(shù)字光處理(digital light processing，DLP) 技術(shù)，是感光性材料經(jīng)光源照射后迅速發(fā)生固化，逐層沉積，最終實(shí)現(xiàn)三維打印成型。立體光刻法不是基于噴嘴方式，而是液體材料位于樹(shù)脂浴中，其中構(gòu)建板降低并且光源跟蹤編程圖案僅交聯(lián)設(shè)計(jì)的部分，該過(guò)程可逐層讓材料沉積，直到物體成型完成 [ 10 ]，它避免了在其他技術(shù)中通常觀察到的細(xì)胞上的剪切應(yīng)力。SLA和DLP技術(shù)間的區(qū)別是使用的光源不同，SLA使用激光，而DLP使用來(lái)自投影的光源。激光系統(tǒng)逐點(diǎn)誘導(dǎo)光敏材料的選擇性交聯(lián)，而DLP系統(tǒng)使用動(dòng)態(tài)反射鏡陣列，選擇性地將光投射到區(qū)域中，以交叉鏈接分配給每個(gè)層的所有點(diǎn) [ 11 ]。SLA或DLP基于光敏聚合物原料，可以獲得較高的結(jié)構(gòu)精度和穩(wěn)定性，并且SLA立體成型成熟度最高，成型速度快，尺寸精度高，適用于光敏水凝膠(如雙鍵改性的明膠和透明質(zhì)酸)構(gòu)建軟骨支架和生物打印。常用的感光性水凝膠材料如甲基丙烯酸化的藻酸鹽、明膠、聚乙二醇等可用于軟骨組織工程構(gòu)建 [ 12 ]。

3．LDM
LDM在受控的冷卻室的作用下，使復(fù)合漿料或溶液在沉積過(guò)程中始終保持低溫狀態(tài) [ 13 ]。LDM適用于高分子漿料、混合生物材料和聚合物的打印，可實(shí)現(xiàn)高精度復(fù)合漿料沉積，并且可以通過(guò)冷凍干燥在材料表面形成微孔，但是LDM可能會(huì)在構(gòu)建體中殘留有機(jī)溶劑 [ 9 ]。

4．SLS
SLS是一種在計(jì)算機(jī)控制下進(jìn)行激光掃描，以在工作平臺(tái)上熔化和粘結(jié)粉末材料的技術(shù)。當(dāng)一層掃描完成后，在固化層的表面涂上一層新的粉末材料，對(duì)其進(jìn)行掃描并逐層粘合，以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)。SLS主要適用于金屬粉末、塑料和陶瓷的打印。SLS無(wú)需使用支撐材料，加工速度快，但是持續(xù)高溫可能會(huì)導(dǎo)致聚合物材料降解，產(chǎn)品表面粗糙且需要后處理，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生灰塵和有毒氣體。因此，SLS不適用于水凝膠成型 [ 9 ]。

(二)三維生物打印
三維生物打印是眾多三維打印技術(shù)中的一個(gè)分支，也是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的一種先進(jìn)輔助技術(shù)手段 [ 14 , 15 ]。目前三維打印技術(shù)廣泛應(yīng)用于軟骨支架的打印，由于材料特性以及成型條件限制，需要在軟骨支架打印成型后接種種子細(xì)胞。而三維生物打印以活體細(xì)胞與支架材料為生物墨水進(jìn)行同步打印，最終形成具有生理功能的組織或器官。傳統(tǒng)三維打印技術(shù)無(wú)法精準(zhǔn)調(diào)控接種在軟骨支架上種子細(xì)胞的空間分布，所構(gòu)建的微環(huán)境與體內(nèi)差異大。三維生物打印彌補(bǔ)了傳統(tǒng)三維打印的缺點(diǎn)，精細(xì)控制細(xì)胞分布以及機(jī)械、化學(xué)性質(zhì)的調(diào)節(jié)，可以更好地模擬天然軟骨的解剖結(jié)構(gòu)及其生理功能 [ 9 , 16 ]。這開(kāi)辟了許多新的視角，包括通過(guò)開(kāi)發(fā)復(fù)雜結(jié)構(gòu)(如骨軟骨隔室)、不同類型的軟骨(透明軟骨、纖維軟骨、彈性軟骨)和根據(jù)特定患者的需要，構(gòu)建個(gè)性化醫(yī)療。三維生物打印的關(guān)鍵要素在于生物墨水的設(shè)計(jì)，傳統(tǒng)三維打印軟骨支架時(shí)，由于沒(méi)有活體細(xì)胞的存在，可選擇的打印方式較多，打印條件可較為苛刻，如冷凍、加熱、高強(qiáng)度光交聯(lián)等；傳統(tǒng)三維打印可選擇的打印墨水較為寬泛，如水凝膠的水相溶液、熱塑性高分子的有機(jī)溶液或熔融漿料；傳統(tǒng)三維打印可控制的打印墨水的參數(shù)自由度較大，可最大限度提高支架材料的濃度和黏度以獲取更加理想的結(jié)構(gòu)成型效果。而三維生物打印由于生物墨水中活細(xì)胞的存在，為保持細(xì)胞的生物活性，可選擇的打印方式較少，生物墨水的制備和打印也需避免苛刻的環(huán)境；由于水凝膠十分接近天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),細(xì)胞可以在水凝膠內(nèi)部存活，因此水凝膠是目前制備生物墨水的最主要材料 [ 17 , 18 ]。三維生物打印成型性能(與結(jié)構(gòu)相關(guān))和細(xì)胞活性(與功能相關(guān))對(duì)于生物墨水的特性(如黏度、強(qiáng)度等)有著相反的要求，前者希望生物墨水有較高的濃度、交聯(lián)密度等，后者正好相反。由于單種水凝膠存在各自的缺陷，復(fù)合生物墨水體系已成為軟骨生物打印的主流。目前，三維生物打印技術(shù)還處于發(fā)展階段，適宜的生物墨水較少是限制其發(fā)展的重要原因之一，開(kāi)發(fā)更多可供選擇的生物墨水是目前三維生物打印技術(shù)重要的研究方向 [ 19 , 20 ]。

二、三維打印技術(shù)在關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)用
（一)關(guān)節(jié)骨軟骨解剖結(jié)構(gòu)和功能
骨軟骨組織構(gòu)造精細(xì)且復(fù)雜，在解剖結(jié)構(gòu)上關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨互相連接，具有特定的骨軟骨單元結(jié)構(gòu)梯度和生物學(xué)特性。骨軟骨界面是一個(gè)呈連續(xù)性變化的整體，由上而下軟骨組織具有不同的微觀解剖結(jié)構(gòu)、力學(xué)特性以及生物學(xué)特性 [ 21 ]。在微觀解剖學(xué)中，關(guān)節(jié)軟骨自上而下可分為3層：關(guān)節(jié)軟骨層、鈣化軟骨層和軟骨下骨層( 圖2 )。其中關(guān)節(jié)軟骨層包括軟骨表層、中層和深層。關(guān)節(jié)軟骨層又稱透明軟骨層，透明軟骨層和鈣化軟骨層交界區(qū)被稱作潮線，它是嵌合在軟骨深層與鈣化軟骨層中的一個(gè)彼此交錯(cuò)的三維結(jié)構(gòu)，將較軟的透明軟骨組織與較硬的鈣化軟骨連接在一起。鈣化軟骨層和軟骨下骨層的交界區(qū)被稱作水泥線或粘合線，將兩側(cè)結(jié)構(gòu)交錯(cuò)結(jié)合錨定在一起。

關(guān)節(jié)軟骨層主要由水、ECM(主要是Ⅱ型膠原纖維)和軟骨細(xì)胞組成。膠原纖維直徑和方向、各層含水量、細(xì)胞形態(tài)和種類等由軟骨表層至深層逐漸發(fā)生變化。膠原纖維在軟骨表層直徑較細(xì)、排列密集、與關(guān)節(jié)表面相平行；在軟骨中層，直徑增粗、排列隨意；在軟骨深層，膠原纖維直徑進(jìn)一步增粗、與關(guān)節(jié)表面相垂直，部分來(lái)自軟骨深層的粗大膠原纖維貫穿潮線將軟骨深層與鈣化軟骨層緊緊連接。含水量在軟骨表層最高，隨著深度的增加逐漸降低，軟骨深層含水量最低。由于含水量與滲透率呈正相關(guān)，軟骨深層滲透率最低，幾乎沒(méi)有液體能夠通過(guò)該組織，因此該層受到的界面剪切力也最大。

鈣化軟骨層是位于關(guān)節(jié)軟骨層與軟骨下骨層之間的一層鈣化骨組織，是一種天然界層結(jié)構(gòu)。鈣化軟骨層軟骨細(xì)胞含量、含水量進(jìn)一步降低，同時(shí)出現(xiàn)組織鈣化。軟骨的抗壓模量和抗壓強(qiáng)度從表層到深部逐漸增加，鈣化軟骨層形態(tài)致密，其硬度為關(guān)節(jié)軟骨層的10倍，為軟骨下骨層的1/60。在力學(xué)性能方面，鈣化軟骨層起承載多變剪切力、緩沖力以及連接作用，使得關(guān)節(jié)在運(yùn)動(dòng)時(shí)受的力學(xué)沖擊顯著降低，并且將關(guān)節(jié)軟骨的剪切力轉(zhuǎn)化為壓應(yīng)力傳遞至軟骨下骨，大大降低了關(guān)節(jié)軟骨被壓碎和撕裂的可能性。另外，鈣化軟骨層有屏障作用，阻礙了關(guān)節(jié)軟骨層與軟骨下骨層之間的物質(zhì)交換 [ 22 ]。

軟骨下骨層由水(約10%)、透明質(zhì)酸、糖蛋白(Ⅰ型和Ⅴ型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白)和礦物質(zhì)成分組成。軟骨下骨是高度血管化的生物礦化結(jié)締組織，大量的透明質(zhì)酸和Ⅰ型膠原纖維為軟骨下骨提供了強(qiáng)大的抗壓強(qiáng)度和強(qiáng)大的硬度，與軟骨相比，軟骨下骨具有更高的壓縮模量和更低的彈性模量。

(二)三維打印技術(shù)方案
整體來(lái)看，關(guān)節(jié)軟骨自上而下含水率逐漸降低，蛋白多糖以及鈣化程度逐漸升高。正因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨有很強(qiáng)的層次遞進(jìn)性，從而導(dǎo)致了其具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性 [ 23 ]。而三維打印技術(shù)逐層組裝的特點(diǎn)使得種子細(xì)胞、生物活性因子和生物材料在三維空間中可以精準(zhǔn)排列分布 [ 24 ]。此外，由于軟骨損傷的同時(shí)往往伴有軟骨下骨的損傷，三維打印技術(shù)可用于制造具有細(xì)胞梯度及排列結(jié)構(gòu)的軟骨支架，因此在構(gòu)建雙相及多相仿生支架時(shí)具有極大優(yōu)勢(shì)。目前常見(jiàn)的軟骨支架可分為離散型仿生支架和連續(xù)型仿生支架。離散型仿生支架又可分為單相支架、雙相支架和多相支架等 [ 25 ]。

單相支架由一種或多種材料制備而成，具有相同結(jié)構(gòu)、成分、力學(xué)屬性，其單一的孔徑率和機(jī)械性能無(wú)法滿足關(guān)節(jié)軟骨漸變的組織結(jié)構(gòu)和功能變化的要求。雙相支架通常具有軟骨相和骨相2層結(jié)構(gòu)，且各分層在成分、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能上更加接近軟骨組織結(jié)構(gòu)，能夠一定程度上構(gòu)建軟骨-骨一體化修復(fù) [ 26 ]。Swieszkowski等 [ 27 ]使用了由纖維蛋白/PCL和PCL/PCL-磷酸三鈣相組成的雙相結(jié)構(gòu)。這2個(gè)結(jié)構(gòu)接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，分別用于軟骨和骨再生的成軟骨培養(yǎng)基和成骨培養(yǎng)基。最后，使用纖維蛋白膠將2個(gè)結(jié)構(gòu)整合成1個(gè)構(gòu)建體，可以清楚觀察到軟骨再生和新骨形成。但是雙相軟骨支架缺少了鈣化軟骨層，且支架置入后有支架斷裂等并發(fā)癥，所以三相及多相支架在軟骨-骨一體化修復(fù)中有更大優(yōu)勢(shì)。三相及多相支架能夠更好地模擬出天然軟骨的分層結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能上的變化，從而構(gòu)建出理想的仿生軟骨。Du等 [ 28 ]使用SLS技術(shù)制備了由PCL和透明質(zhì)酸/PCL微球組成的多相骨軟骨支架，該仿生支架具有連續(xù)多層結(jié)構(gòu)，模擬了從關(guān)節(jié)軟骨層到軟骨下骨層的梯度組成變化。結(jié)果表明，多相支架具有高度互連的孔隙率和理想的機(jī)械性能，以及優(yōu)異的生物相容性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)評(píng)估進(jìn)一步證實(shí)，多相支架可成功誘導(dǎo)骨軟骨修復(fù)，新形成的組織表現(xiàn)出多種組織類型，包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨。相較于離散型骨軟骨支架，連續(xù)型仿生軟骨支架顯著降低了支架分離等并發(fā)癥的發(fā)生，連續(xù)型仿生軟骨支架可將各層成分、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能逐漸平穩(wěn)過(guò)渡，通過(guò)一體化構(gòu)造增強(qiáng)了支架的穩(wěn)定性 [ 29 ]。Gao等 [ 30 ]通過(guò)雙氫鍵單體、N-丙烯酰甘氨酸酰胺(NAGA)和N-[三(羥甲基)甲基]丙烯酰胺(THMMA)共聚合成了高強(qiáng)度熱響應(yīng)超分子共聚物水凝膠。NAGA/THMMA共聚單體水凝膠(PNT水凝膠)顯示出溫度敏感的可逆凝膠↔溶膠轉(zhuǎn)變和剪切減薄行為，因此可通過(guò)三維生物打印制備具有梯度成分(頂層加載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，底層結(jié)合β-磷酸三鈣)的連續(xù)型仿生軟骨支架，所得梯度支架保持高保真度和分辨率，具有高度互連的孔隙和理想的機(jī)械性能以及優(yōu)異的生物相容性。此外，這種在不同層上印刷有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和β-磷酸三鈣的生物雜交梯度水凝膠的支架有助于體外人骨髓干細(xì)胞的附著、擴(kuò)散、成軟骨和成骨分化。

三、三維打印技術(shù)在耳廓軟骨的應(yīng)用
軟骨主要以3種形式存在于身體中：彈性軟骨、纖維軟骨和透明軟骨。盡管3種軟骨的特征都是高含水量和由軟骨細(xì)胞支撐、維持，但是其富含Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的ECM之間存在顯著差異，因此每種類型的軟骨都具有不同的功能。例如，位于外耳和會(huì)厭的彈性軟骨具有富含彈性蛋白的ECM，該ECM為組織提供彈性，其主要功能是在重復(fù)彎曲時(shí)提供支撐，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)和形狀。在耳廓彈性軟骨中，由于不同部位的ECM含量分布不同，造成各部位力學(xué)性能的差異 [ 31 ]。耳軟骨ECM主要由蛋白多糖和彈性纖維構(gòu)成，其中耳廓軟骨中央?yún)^(qū)域彈性纖維分布密集，周邊區(qū)域分布稀疏，因此耳廓中的耳屏、耳輪、對(duì)耳屏、對(duì)耳輪、耳甲和耳舟等亞單位結(jié)構(gòu)( 圖3 )具有不同的力學(xué)性能，其中耳輪力學(xué)強(qiáng)度最低，對(duì)耳屏力學(xué)強(qiáng)度最高。耳廓軟骨無(wú)血管、低濃度的細(xì)胞以及固有的不增殖特性使該軟骨無(wú)法在功能、組織上自我愈合或再生 [ 32 ]。

先天性小耳畸形、耳廓外傷、耳廓術(shù)后、耳廓炎癥等各種原因可導(dǎo)致耳廓軟骨不同程度的缺損。耳廓軟骨缺損可影響其生理功能、顏面美觀，嚴(yán)重者可危及患者心理健康，因此耳廓軟骨缺損修復(fù)重建對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。耳廓軟骨組織工程早在20年前已成功開(kāi)展，Cao等 [ 33 ]將牛軟骨細(xì)胞接種在非織造聚乙醇酸網(wǎng)上，用海藻酸鈉模具通過(guò)溶劑澆鑄工藝將其進(jìn)一步嵌入聚乳酸中，從而創(chuàng)造了人工耳。將構(gòu)建體植入無(wú)胸腺小鼠皮下，12周后它們表現(xiàn)出新軟骨的大體組織學(xué)外觀。但是通過(guò)傳統(tǒng)工藝制造的耳軟骨支架在植入體內(nèi)時(shí)發(fā)生坍塌，這也是此軟骨支架的致命弱點(diǎn)。發(fā)展與天然耳廓軟骨不同解剖分區(qū)的力學(xué)性能相適應(yīng)、結(jié)構(gòu)精細(xì)并可長(zhǎng)期穩(wěn)定于體內(nèi)的耳軟骨支架，是組織工程耳軟骨研究和臨床轉(zhuǎn)化迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

三維打印技術(shù)在制備復(fù)雜形狀和多種細(xì)胞類型的耳廓軟骨支架中廣泛應(yīng)用。Xia等 [ 34 ]將明膠和透明質(zhì)酸制備成水凝膠，并采用三維打印以確保外部三維形狀和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)的精確控制；其次，將甲基丙烯酸酐和光引發(fā)劑引入水凝膠系統(tǒng)，以使材料在三維打印期間可光固化；最后，采用冷凍干燥進(jìn)一步提高機(jī)械性能并延長(zhǎng)降解時(shí)間。通過(guò)整合光固化三維打印和冷凍干燥技術(shù)，以明膠和透明質(zhì)酸成功地制成了人耳形狀的支架，與原始數(shù)字模型相比，這種支架的形狀相似程度超過(guò)90%。最重要的是，與軟骨細(xì)胞結(jié)合的支架在體外和自體山羊模型中成功地再生了具有典型腔隙結(jié)構(gòu)和軟骨特異性ECM的成熟軟骨，這充分表明了光固化三維打印技術(shù)特別適合于制造具有精確、復(fù)雜、高質(zhì)量、個(gè)性化的天然支架。Zopf等 [ 35 ]利用基于激光燒結(jié)的三維打印技術(shù)，以PCL作為耳廓重建的原材料，制備患者專用支架，結(jié)果顯示制備的耳廓支架具有高保真度和精細(xì)微孔結(jié)構(gòu)，并支持軟骨再生。生物打印技術(shù)能夠精確沉積生物材料、種子細(xì)胞和生物因子，且允許支架內(nèi)的材料和細(xì)胞發(fā)生變化。近年來(lái)，三維生物打印技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了耳廓軟骨支架的進(jìn)一步進(jìn)展。Jang等 [ 36 ]以PCL和含有脂肪干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞混合物的細(xì)胞負(fù)載藻酸鹽水凝膠為生物墨水，通過(guò)三維生物打印技術(shù)進(jìn)行耳廓框架的精準(zhǔn)構(gòu)建，該耳廓支架具有高度的孔隙率、適當(dāng)?shù)目讖健⒏叨仍鰪?qiáng)的機(jī)械性能，以及與天然耳廓軟骨相似的細(xì)胞梯度。用定量和定性方法評(píng)估體外細(xì)胞活力、增殖和分化，結(jié)果均表明，軟骨細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞在三維支架中共培養(yǎng)后促進(jìn)軟骨生成。此外，使用大鼠模型進(jìn)行了體內(nèi)組織學(xué)分析，顯示該耳廓支架在體內(nèi)存活良好、無(wú)移位、無(wú)炎癥反應(yīng)，并且可再生出相應(yīng)區(qū)域的豐富的腔隙軟骨細(xì)胞和大面積的成熟軟骨。這些研究均表明，快速發(fā)展的三維打印技術(shù)使構(gòu)建精細(xì)結(jié)構(gòu)、與天然耳廓軟骨不同解剖分區(qū)力學(xué)性能相適應(yīng)的天然仿生軟骨支架有望實(shí)現(xiàn)。

四、三維打印技術(shù)在鼻軟骨的應(yīng)用
鼻是人類面部最突出的器官，包括支架結(jié)構(gòu)、支撐系統(tǒng)及外覆組織。支架結(jié)構(gòu)包括骨和軟骨，其由結(jié)締組織和韌帶連接到一起并發(fā)揮支撐作用。皮膚及軟組織覆蓋于其表面。先天性畸形、外傷、燒傷、鼻部術(shù)后均可導(dǎo)致鼻部軟骨缺損，極大影響患者的生活質(zhì)量及心理健康。鼻部軟骨部分包括鼻中隔軟骨、鼻翼軟骨以及側(cè)鼻軟骨( 圖4 )，占據(jù)鼻部的2/3。鼻翼軟骨是構(gòu)成鼻下部1/3的主要成分，其輪廓決定著鼻尖的固有特征，鼻翼軟骨與側(cè)鼻軟骨、鼻中隔軟骨之間的相互連接與鼻尖部的支撐、位置、輪廓密切相關(guān)，共同構(gòu)建了鼻部重要的美學(xué)尺度。因此，鼻重建和鼻軟骨再生一直是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。過(guò)去20年中，組織工程取得了巨大進(jìn)展，但大多數(shù)研究的結(jié)果都是形狀不規(guī)則的軟骨珠，不夠精確 [ 37 ]。

三維打印技術(shù)基于患者的CT圖像數(shù)據(jù)或三維全息顯示進(jìn)行術(shù)前鼻模擬，根據(jù)患者要求，精確確定鼻形狀、體積、鼻背高度、鼻翼曲率、鼻尖高度等細(xì)節(jié)，借助三維打印技術(shù)(包括CAD/CAM)生產(chǎn)定制精確、復(fù)雜的鼻軟骨形狀 [ 38 ]。此外，傳統(tǒng)的人工鼻置入物永久存在于患者體內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致感染和免疫反應(yīng)等并發(fā)癥。三維打印鼻置入物由選定的可生物降解材料制成，減少了并發(fā)癥發(fā)生，是隆鼻術(shù)的合適移植物 [ 39 ]。選擇和定制合適的材料從功能和美學(xué)上重建鼻是確保手術(shù)成功的關(guān)鍵。目前，PCL已成為組織工程領(lǐng)域的一種適用聚合物，因?yàn)樗�具有生物相容性，在體內(nèi)可安全分解(超過(guò)3～4年)。PCL也非常適合在三維打印技術(shù)中用作支架或植入物 [ 40 ]。它在60 ℃熔化，而不需要有毒溶劑溶解，可以在計(jì)算機(jī)控制的模式擠出以逐層構(gòu)建結(jié)構(gòu)。這些特性可以使其有效地用于設(shè)計(jì)和定制患者個(gè)性化的部件。Park等 [ 41 ]證實(shí)PCL易于使用，可避免手術(shù)時(shí)間增加和發(fā)生相關(guān)并發(fā)癥，大體形態(tài)學(xué)觀察顯示，兔術(shù)前的鈍鼻外觀變?yōu)殇J利而精致的外觀，矯正效果可保持12周。三維打印的PCL鼻支架顯示出優(yōu)異的生物相容性和形狀保持性，可作為鼻整形和顱面重建的臨床生物相容性材料。然而，一些可生物降解并獲得美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的支架材料并不具有鼻硅膠置入物的柔韌性，因此會(huì)發(fā)生擠壓、感染、外露等風(fēng)險(xiǎn) [ 42 ]。評(píng)估支架材料在體內(nèi)是否具有完全的生物相容性是一個(gè)嚴(yán)格和長(zhǎng)期的過(guò)程，新生物材料很難獲得臨床應(yīng)用的批準(zhǔn)。改變支架的結(jié)構(gòu)來(lái)提高支架的靈活性是一個(gè)新思路。Jung等 [ 43 ]使用基于投影的微立體光刻和犧牲模塑，制造了具有相同孔隙率和相同晶胞尺寸的八面體、立方體或晶格孔結(jié)構(gòu)的支架，并使用壓縮和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)分析了其力學(xué)行為。與其他孔隙類型相比，八面體孔隙結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的柔韌性，在置入鼻子后可保持其機(jī)械穩(wěn)定性。

在鼻軟骨生物三維打印中，噴墨打印和擠出打印是最常用的技術(shù)，水凝膠作為一種含水量高的三維高分子網(wǎng)絡(luò)，其在結(jié)構(gòu)上模擬ECM，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供"支架"，是生物三維打印常用的墨水材料 [ 44 ]。作為載體材料，水凝膠的性質(zhì)決定了生物三維打印的成敗與質(zhì)量，其需要具有良好的可打印性并能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜微環(huán)境。然而，普通水凝膠的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)不夠均勻且缺乏能量耗散機(jī)制，機(jī)械性能較差，無(wú)法成為兼顧可打印性及生物相容性的"好用"生物墨水。理想的鼻軟骨支架要求具有長(zhǎng)期的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。為了補(bǔ)償水凝膠無(wú)法保持均勻的三維結(jié)構(gòu)，納米纖維素/海藻酸鈉水凝膠作為一種新型生物墨水，結(jié)合了納米纖維素的剪切變稀行為和海藻酸鈉的快速交聯(lián)能力，具有強(qiáng)大的穩(wěn)定性和整合性，目前廣泛用于鼻軟骨重建 [ 45 , 46 , 47 ]。Möller等 [ 46 ]應(yīng)用這種新型生物墨水，基于擠出型三維生物打印技術(shù)，成功打印出鼻軟骨支架。該鼻軟骨支架在小鼠體內(nèi)植入60 d后顯示出良好的機(jī)械穩(wěn)定性，并觀察到糖胺聚糖產(chǎn)量和鼻軟骨細(xì)胞增殖的逐漸增加，免疫組化顯示出明顯的細(xì)胞增殖和人Ⅱ型膠原沉積，證實(shí)了三維生物打印的人細(xì)胞負(fù)載水凝膠構(gòu)建體中的體內(nèi)鼻軟骨的生成。Apelgren等 [ 45 ]同樣使用納米纖維素、藻酸鹽與人軟骨細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合，使用三維擠出式生物打印機(jī)制造構(gòu)建體(5.0 mm×5.0 mm×1.2 mm)。生物打印后立即將構(gòu)建體植入48只裸鼠的背部皮下，分別在30和60 d后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查，結(jié)果顯示構(gòu)建體中的人鼻軟骨細(xì)胞顯示出良好的增殖能力，60 d后17.2%的表面積被增殖的軟骨細(xì)胞覆蓋。在包含軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞混合物的構(gòu)建體中，可觀察到軟骨細(xì)胞合成的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原含量增加。該研究表明，三維生物打印是一種有前途的人類軟骨制作技術(shù)。此外，為了再現(xiàn)鼻軟骨的多層異質(zhì)結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)整個(gè)鼻再生，Jodat等 [ 48 ]用集成生物傳感系統(tǒng)打印了雙生物墨水的鼻狀結(jié)構(gòu)。該構(gòu)建體由多層軟質(zhì)和硬質(zhì)生物墨水組成，在生物相容性條件下實(shí)現(xiàn)氣味感知，軟骨細(xì)胞負(fù)載的三維生物打印軟骨樣結(jié)構(gòu)帶有電子嗅覺(jué)模擬生物傳感器。由甲基丙烯�；�水凝膠和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯組成的光交聯(lián)水凝膠生物墨水可以通過(guò)調(diào)節(jié)生物墨水的機(jī)械性能，形成一個(gè)機(jī)械穩(wěn)定性強(qiáng)、生物相容度高的三維微環(huán)境，以支持軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。因此，可以優(yōu)化由不同濃度水凝膠組成的具有硬、軟機(jī)械性能的2種不同生物墨水，以模擬鼻軟骨中天然ECM的機(jī)械性能，從而允許鼻軟骨組織的形成。

五、未來(lái)與展望
綜上所述，骨軟骨組織結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，骨軟骨缺損的再生仍然是組織工程和整形外科的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。目前，已經(jīng)通過(guò)三維打印技術(shù)獲得了軟骨(關(guān)節(jié)軟骨、半月板、椎間盤、耳廓、鼻)的三維模型和支架。然而，在制備各向異性軟骨的功能構(gòu)建體方面仍存在一些挑戰(zhàn)。由于關(guān)節(jié)軟骨、半月板和椎間盤位于人體的承重部位，因此其軟骨支架需要具備一定機(jī)械強(qiáng)度。耳廓、鼻等軟骨為防止植入后的吸收、變性和鈣化，不僅需要一定的彈性，也需要一定的機(jī)械強(qiáng)度 [ 48 ]。在組織再生和修復(fù)期間，組分的區(qū)域梯度(如不同的細(xì)胞和生物活性分子)和結(jié)構(gòu)區(qū)域梯度(如不同的孔徑、微結(jié)構(gòu)和材料硬度)影響細(xì)胞增殖、遷移和分化，以及構(gòu)建體的機(jī)械性能。因此，探索如何制造不同的軟骨結(jié)構(gòu)和仿生梯度非常重要。傳統(tǒng)三維打印技術(shù)可一定程度上模擬體內(nèi)軟骨的結(jié)構(gòu)生理特點(diǎn)，但三維生物打印技術(shù)通過(guò)使用CAD/CAM技術(shù)的空間和時(shí)間控制沉積來(lái)實(shí)現(xiàn)外部形狀、內(nèi)部孔隙率、活性細(xì)胞分布的精確控制，從而為仿生軟骨的制備提供更好的解決方案。但三維生物打印技術(shù)尚不成熟，需要進(jìn)一步提高分辨率和準(zhǔn)確性。當(dāng)前我們應(yīng)該聚焦于改進(jìn)三維打印技術(shù)和支架材料，制造具有適當(dāng)生物力學(xué)特性的構(gòu)建體，并通過(guò)印刷來(lái)保證較高的細(xì)胞存活率和生物分子活性，才能確保仿生組織和器官的構(gòu)建。軟骨組織工程的發(fā)展趨勢(shì)是將天然材料與合成材料相結(jié)合，以充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)。目前已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)許多共聚物，有望成為軟骨重建的理想材料。選擇具有適當(dāng)生物力學(xué)特性、生物相容性和表面形態(tài)的支架是促進(jìn)軟骨形成的關(guān)鍵，科學(xué)家需要繼續(xù)努力。

目前，四維打印和智能材料的出現(xiàn)為軟骨組織工程打開(kāi)了新渠道。四維打印特指對(duì)智能材料的三維打印制造。相較于傳統(tǒng)的三維打印，四維打印增加了"時(shí)間"這一維度，它使得所打印物體的物理特性(例如形狀、顏色、尺寸等)能夠響應(yīng)外界刺激(諸如溫度、光、有機(jī)溶劑、濕度等) [ 49 ]。四維打印通過(guò)給靜態(tài)打印結(jié)構(gòu)賦予動(dòng)態(tài)屬性，在熱、光、pH、水分、電和磁場(chǎng)等各種刺激下，打印物體的形狀和(或)屬性隨著時(shí)間的推移會(huì)發(fā)生變化，從而可以將材料的三維打印加工拓展到復(fù)雜幾何形狀之外。近年來(lái)，隨著智能材料和新型打印方法的快速發(fā)展，大大擴(kuò)大了四維打印的范圍 [ 50 , 51 ]。智能生物材料可以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，提供良好的組織修復(fù)和再生微環(huán)境，從而誘導(dǎo)軟骨修復(fù)和再生。這一過(guò)程通過(guò)被動(dòng)響應(yīng)外源或內(nèi)源性刺激，調(diào)整材料的結(jié)構(gòu)和功能，以接近于天然軟骨；或者通過(guò)主動(dòng)提供生理生化、物理信號(hào)因子，來(lái)控制藥物或生物活性因子的釋放調(diào)節(jié)此過(guò)程。應(yīng)用智能生物材料構(gòu)建能夠與細(xì)胞和生物活性因子結(jié)合的軟骨組織工程支架，被認(rèn)為是軟骨修復(fù)和再生的有效和有前途的策略。然而，目前臨床上使用的智能生物材料很少。事實(shí)上，只有5%的生命科學(xué)發(fā)現(xiàn)從學(xué)術(shù)環(huán)境中最終轉(zhuǎn)化用于臨床、新藥、診斷或設(shè)備。因此，臨床需求必須是開(kāi)發(fā)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)和再生的智能生物材料的基礎(chǔ)。生物材料，甚至是惰性生物材料，可以改善與細(xì)胞和組織的相互作用，并通過(guò)先進(jìn)的制造技術(shù)獲得智能 [ 52 ]�？茖W(xué)家們更應(yīng)該使智能生物材料與先進(jìn)的制造技術(shù)(三維、四維打印技術(shù))相結(jié)合，推進(jìn)軟骨組織工程的進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：略