《AM》：一種應(yīng)用于3D打印的自組裝雙親肽

來(lái)源： 超分子生物制造

基于擠出式打印的3D生物打印已被廣泛應(yīng)用于復(fù)制生物體內(nèi)自然存在的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其中生物墨水的性質(zhì)至關(guān)重要，因此墨水材料的開發(fā)極具前景。目前使用的生物墨水多由透明質(zhì)酸、海藻酸鹽及脫細(xì)胞基質(zhì)等天然來(lái)源的水凝膠材料組成，或?qū)⑦@些材料通過(guò)化學(xué)改性的方法進(jìn)行改良，這種方法可以在保持天然材料原有生物相容性的基礎(chǔ)上增強(qiáng)材料的打印性，使其具有保真度和打印結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，目前該領(lǐng)域已取得廣泛進(jìn)展，但單純化學(xué)改性的方法仍難保持生物性和打印性的平衡，且不同批次間存在差異，難以保證穩(wěn)定的打印質(zhì)量。

自組裝肽(self-assembling peptides, SAPs）因其在材料機(jī)械、生物及化學(xué)的可設(shè)計(jì)性被廣泛應(yīng)用于開發(fā)新的生物墨水，SAPs僅由氨基酸組件構(gòu)成，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的特定SAPs通過(guò)超分子組裝成指定結(jié)構(gòu)的納米級(jí)多肽，再進(jìn)一步組裝成宏觀結(jié)構(gòu)的水凝膠，即模塊化的合成過(guò)程，可以通過(guò)簡(jiǎn)單地改變其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列或加入生物活性肽序列來(lái)改變SAPs的性質(zhì)，因此具有易合成、成分明確及設(shè)計(jì)靈活性等優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)的材料性質(zhì)范圍廣，在擠出式生物打印墨水的開發(fā)領(lǐng)域極具吸引力。

研究簡(jiǎn)介

來(lái)自美國(guó)萊斯大學(xué)的Jeffrey D. Hartgerink教授團(tuán)隊(duì)將多結(jié)構(gòu)域肽（multidomain peptides, MDPs）作為一種新的生物墨水應(yīng)用于擠出式3D生物打印以創(chuàng)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)多材料打印，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)揭示了電荷差異對(duì)細(xì)胞活性及形態(tài)的影響，探索并通過(guò)調(diào)控MDPs內(nèi)電荷來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。MDPs是一類SAPs，可在生理pH及離子條件下形成納米纖維水凝膠。MDPs具有交替的疏水性和親水性氨基酸的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，帶電殘基位于兩側(cè)，通過(guò)帶電離子間相互作用形成“疏水夾層”，從而組裝為β片層結(jié)構(gòu)的有序纖維，并在適當(dāng)?shù)臐舛认驴焖倌�膠化成納米纖維水凝膠，可作為生物墨水應(yīng)用于擠出式打印。本文使用攜帶相反電荷的兩種MDPs進(jìn)行3D打印的參數(shù)優(yōu)化以及構(gòu)建復(fù)雜圖形，并在體外通過(guò)兩種墨水的組合構(gòu)建支架以觀察并調(diào)控細(xì)胞行為。相關(guān)工作以題為“3D Printing of Self-Assembling Nanofibrous Multidomain Peptide Hydrogels”的文章發(fā)表在2023年1月的《AdvancedMaterials》雜志上。（DOI: 10.1002/adma.202210378）

圖1：MDPs的組裝和3D打印原理示意圖

研究?jī)?nèi)容

1.多結(jié)構(gòu)域肽的表征

本研究中使用了兩種不同的電荷的MDPs，其中陽(yáng)離子MDPs序列為K2(SL)6K2，命名為K2，陰離子MDPs序列為E2(SL)6E2，命名為E2。圓二色譜結(jié)果顯示K2及E2均表現(xiàn)為β片層特征性結(jié)構(gòu)（圖2a），其中K2序列因賴氨酸上的氨基和谷氨酸上的羧基之間的差異呈現(xiàn)更強(qiáng)的β片層結(jié)構(gòu)。掃描電鏡可見K2及E2水凝膠的纖維結(jié)構(gòu)，低倍鏡下可見兩種水凝膠表面均表現(xiàn)為密集的纖維結(jié)構(gòu)（圖2c、e），高倍鏡下可見兩種水凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2d、f）。

圖2：MDPs二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀納米纖維網(wǎng)絡(luò)表征

2.多結(jié)構(gòu)域肽墨水打印參數(shù)優(yōu)化

為了評(píng)估兩種MDPs用于擠出式墨水的可打印性，通過(guò)流變學(xué)測(cè)試評(píng)估了肽濃度對(duì)水凝膠儲(chǔ)存模量的影響（圖3a、e），在濃度相同的情況下，K2凝膠的儲(chǔ)存模量G‘平均比 E2 凝膠大4.2倍，每增加一個(gè)濃度梯度，兩種 MDPs水凝膠的G’都會(huì)增加約2倍。在保證溶解度的條件下，通過(guò)流變學(xué)測(cè)試驗(yàn)證了濃度最高（G‘最高）的MDPs水凝膠的剪切稀化及快速自愈合等3D可打印墨水的基本特性（圖3b、f）。

MDPs的交聯(lián)方式與大部分生物墨水材料需要共價(jià)交聯(lián)不同，MDPs僅依靠超分子力進(jìn)行組裝，意味著MDPs水凝膠能在打印過(guò)程中保持動(dòng)態(tài)組裝的狀態(tài)。因此通過(guò)使用不同批次MDPs、改變溫度和時(shí)間對(duì)流變性能的影響驗(yàn)證MDPs水凝膠的穩(wěn)定性，對(duì)每種水凝膠進(jìn)行3次重復(fù)流變性能測(cè)試，結(jié)構(gòu)顯示與初始結(jié)果相符（圖3i）。此外，MDPs水凝膠在4-37°C之間顯示出穩(wěn)定的流變學(xué)特性，兩種4%濃度的MDPs水凝膠平均僅產(chǎn)生約5%的變化（圖3j），因此利于在37 °C 條件下體外接種細(xì)胞或體內(nèi)植入支架。MDP水凝膠在4°C下儲(chǔ)存時(shí)也表現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定性（圖3k）。在4°C下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)2.5個(gè)月后，不同儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)度條件下的水凝膠的流變特性的變化可以忽略不計(jì)。與時(shí)間敏感型水凝膠相比，MDPs水凝膠具備更大的靈活性和按需使用的能力。

圖3：MDPs水凝膠和MDPs墨水的流變特性

使用Allevi 3生物打印機(jī)對(duì)4%濃度K2墨水、4%濃度E2墨水和3%濃度K2墨水進(jìn)行打印參數(shù)的優(yōu)化。以0.5PSI的增量增加壓力至墨水可以呈長(zhǎng)絲狀流出以確定最小擠出壓力（圖4a）。從25G針頭擠出的長(zhǎng)絲的理想高度和寬度為250μm，即針頭的內(nèi)徑。纖維在高速打印時(shí)會(huì)斷裂，最小打印速度為300mm/min，通過(guò)此方法可以確定使用不同規(guī)格針頭下最佳打印速度。使用最佳的壓力和打印速度可以使三種墨水進(jìn)行懸垂打�。▓D4b）。僅在8mm和16mm的懸伸處觀察到打印結(jié)構(gòu)的輕微偏轉(zhuǎn)，表明非共價(jià)組裝的方式足夠堅(jiān)固以支撐打印結(jié)構(gòu)，從而避免了共價(jià)交聯(lián)的需要。4%濃度 K2墨水成功打印出的圓柱體側(cè)面光滑，無(wú)明顯缺陷（圖4c），進(jìn)一步可打印出各種復(fù)雜分層結(jié)構(gòu)（圖4d-g）。將支架打印后直接在HBSS溶液中孵育24 h，仍保持其結(jié)構(gòu)和內(nèi)部孔隙率（圖4h）。

圖4：3D打印MDPs支架的參數(shù)優(yōu)化和打印結(jié)構(gòu)

3.體外實(shí)驗(yàn)

本研究采用僅由K2支架、E2支架以及第一層為K2，第二層為E2的K2/E2支架接種上C2C12細(xì)胞（小鼠成肌細(xì)胞）來(lái)驗(yàn)證電荷對(duì)細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示與E2支架相比，粘附于K2支架上的細(xì)胞更多且增殖情況更佳，細(xì)胞在兩種MDPs支架上培養(yǎng)第5天后數(shù)量都明顯增多，表明E2支架對(duì)于細(xì)胞的弱粘附性會(huì)減慢其增殖速度但不會(huì)阻止增殖。細(xì)胞在K2/E2支架上培養(yǎng)10天仍可見高細(xì)胞活力，證實(shí)了結(jié)合了相反電荷的MDPs不會(huì)引起細(xì)胞毒性，且可見細(xì)胞增殖的差異，其中內(nèi)部K2區(qū)域細(xì)胞伸展情況佳，而外部 E2區(qū)域顯示出較少的匯合度和更多的球形細(xì)胞（圖5a、b)。對(duì)肌動(dòng)蛋白染色可觀察到成肌細(xì)胞在K2支架上融合成肌管并向多個(gè)方向延伸。而E2支架上的細(xì)胞體積更小且肌動(dòng)蛋白絲更少，K2/E2支架上細(xì)胞形態(tài)由細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域的支架決定，同時(shí)也受到附近帶相反電荷的肽的影響（圖5f），K2區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白絲更為散在且觀察到明顯的細(xì)胞核聚集。相比之下，E2區(qū)域的細(xì)胞以球形為主，可以觀察到部分肌動(dòng)蛋白絲從細(xì)胞內(nèi)伸出，而在僅由E2水凝膠打印的支架中沒有觀察到這種現(xiàn)象。結(jié)果表明，K2墨水和E2墨水可以一起使用來(lái)調(diào)控體外的細(xì)胞行為。

圖5:具有不同電荷的MDPs支架水凝膠的體外表征

亮點(diǎn)總結(jié)

1. 通過(guò)設(shè)計(jì)MDPs水凝膠實(shí)現(xiàn)了全新的非共價(jià)鍵交聯(lián)生物墨水用于實(shí)現(xiàn)全液體3D打印，打印條件簡(jiǎn)單可控，墨水性質(zhì)穩(wěn)定堅(jiān)固且保真度高；

2. MDPs僅由多肽構(gòu)成，成分簡(jiǎn)單明確。且打印過(guò)程中無(wú)需引入其他交聯(lián)劑，非共價(jià)鍵交聯(lián)的組裝方式保證了水凝膠的生物安全性；

3. MDPs水凝膠的電荷、機(jī)械性能等可影響細(xì)胞活性及行為的特性皆可被人為設(shè)計(jì)，因此可成為進(jìn)一步開發(fā)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的理想候選生物墨水，未來(lái)可利用該生物墨水打印更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)以及探索其他支架特性對(duì)各種類型細(xì)胞的影響。