微流控氣泡發(fā)生器與數(shù)字光處理平臺(tái)（DLP）用于3D多孔生物支架打印

來源： 生物打印與再生工程

3D打印多孔支架的多孔特性使支架具有增強(qiáng)細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、遷移以及細(xì)胞分化能力的功能，也提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸或細(xì)胞代謝物的去除的效率。但目前常用的犧牲微球法因?yàn)樯婕叭芙鉅奚�物的多個(gè)步驟，具有耗時(shí)、靈活性差等問題，也限制了孔尺寸的靈活可控性。而微流控芯片能夠以更簡(jiǎn)單、更快、更可控的方式生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu)�；�于以上原因，越來越多的研究正在基于微流控原理開發(fā)生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu)的新技術(shù)。

近年來，已有學(xué)者將微流控芯片與擠出式打印機(jī)結(jié)合，雖然該方法操作簡(jiǎn)單，但在制造具有復(fù)雜內(nèi)部架構(gòu)和外部形狀的體積結(jié)構(gòu)時(shí)，效率往往較低。Yu Shrike Zhang教授團(tuán)隊(duì)選用基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片和具有快速交聯(lián)的優(yōu)勢(shì)的3D數(shù)字光處理（DLP）打印平臺(tái)相結(jié)合，從孔隙生成的大小、2D與3D打印的復(fù)雜度，支架的生物相容性等方面證實(shí)了這項(xiàng)結(jié)合技術(shù)有望增強(qiáng)天然多孔組織的模仿特性。

圖1 工作中使用的主要組件（A）VFF芯片（B）DLP平臺(tái)

一、表面活性劑的選擇
表面活性劑可以降低空氣-液體界面的表面張力，防止氣泡破裂或合并，確保一致的打印質(zhì)量和材料特性。因此，該團(tuán)隊(duì)首先測(cè)試了三種表面活性劑（Rhamnolipids、CTAB、Lecithin）對(duì)氣泡的穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明在0.5%（w/v）和5%（w/v）的濃度下，Rhamnolipids的泡沫穩(wěn)定性最差。相比之下，CTAB在5%（w/v）的濃度下比Lecithin的穩(wěn)定效果更好，但0.5%（w/v）的情況下相反。由于Lecithin穩(wěn)定作用的濃度較低，進(jìn)一步降低了其潛在的細(xì)胞毒性，且在5分鐘即大多數(shù)情況的足夠打印時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)最好，因此Lecithin被選為本實(shí)驗(yàn)所用的表面活性劑。該團(tuán)隊(duì)隨后進(jìn)行了濃度梯度實(shí)驗(yàn)（0%、0.5%、1%、3%或5%（w/v），最終選用了1%濃度Lecithin作為最終的表面活性劑選擇。

二、VFF芯片控制氣泡大小的參數(shù)設(shè)定探究
VFF芯片的結(jié)構(gòu)如下圖所示，孔口寬度可以通過改變閥門驅(qū)動(dòng)（valve channel actuation）的壓力大小來控制。在本研究中，該團(tuán)隊(duì)通過改變以下三個(gè)要素：墨水流速（Flow rate），氣體通入壓力（Pg）和閥門驅(qū)動(dòng)的壓力大�。≒v）探究了VFF芯片生成氣泡的大小范圍。

圖2 VFF芯片的通道示意圖

首先，該團(tuán)隊(duì)探究了閥門驅(qū)動(dòng)的壓力大�。≒v）和孔口寬度之間的函數(shù)關(guān)系。結(jié)果顯示兩者服從反S形函數(shù)關(guān)系，在大氣壓力下，孔口寬度約為100μm。在2.3bar的壓力下，孔完全關(guān)閉并在>2.5bar的壓力下斷裂。

接著，該團(tuán)隊(duì)控制Pv為大氣壓強(qiáng)，探究了墨水流速（Flow rate）和氣體通入壓力（Pg）對(duì)于氣泡生成的影響。結(jié)果表明氣體通入壓力以及墨水流速的不同組合可用于產(chǎn)生直徑均勻、標(biāo)準(zhǔn)差小且尺寸可調(diào)的氣泡，大小從211μm至747μm不等。

之后，該團(tuán)隊(duì)改變閥門驅(qū)動(dòng)的壓力大小Pv試圖進(jìn)一步縮小產(chǎn)生的氣泡的尺寸，打破前述的平均約211μm的下限。結(jié)果顯示，氣泡尺寸隨著壓力Pv的增加而減小，呈非線性關(guān)系，氣泡最小縮小至143μm。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還成功測(cè)試了三種參數(shù)的各種組合來證明不同條件下泡沫生成的穩(wěn)健性。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在vFF芯片內(nèi)生成過程中氣泡的大小能夠得到控制，不同工藝參數(shù)的變化范圍從143μm到747μm。

圖3 VFF芯片中不同參數(shù)下孔徑狀態(tài)及氣泡大小

三、2D打印的可行性驗(yàn)證
光引發(fā)劑可以引起化學(xué)交聯(lián)，是實(shí)現(xiàn)2D和3D打印性的重要試劑。因此，該團(tuán)隊(duì)對(duì) LAP（phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphonate) 進(jìn)行了濃度梯度實(shí)驗(yàn)（0.2%、0.4%、1%（w/v），最終選用了1%濃度LAP用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在405納米光下曝光時(shí)間不到15秒即可實(shí)現(xiàn)堅(jiān)固和可重復(fù)的交聯(lián)。

該團(tuán)隊(duì)對(duì)不同復(fù)雜程度的幾何形狀進(jìn)行了打印，使用的是一套共同的工藝參數(shù)——油墨配方為7.5%（w/v）fGelMA，1%（w/v）卵磷脂，1%（w/v）LAP；flow rate=650μL min-1；pg = 1.3 bar；pv =大氣壓力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明工藝參數(shù)不需要根據(jù)幾何形狀進(jìn)行優(yōu)化，且印刷時(shí)間與結(jié)構(gòu)本身的復(fù)雜性無關(guān)。

之后，該團(tuán)隊(duì)使用明場(chǎng)顯微鏡采集并展示了可以精確調(diào)整氣泡直徑的2D打印。通過使用50μL min-1的恒定體積流量，變化區(qū)間為100至250mbar的Pg，變化區(qū)間為0至2.25bar的pv，以2D打印了平均直徑為112 ± 7、198 ± 7、239 ± 19、361 ± 17和424 ± 17微米的氣泡并繪制了直方圖。需要注意的是在這些實(shí)驗(yàn)中使用vFF芯片產(chǎn)生的氣泡平均最大直徑可達(dá)424微米，而vFF芯片內(nèi)最大的氣泡平均直徑可達(dá)747微米。該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為可以歸因于芯片外部的氣泡不再被芯片的高度壓縮，因此變成三維圓形，減少直徑；此外，較大的氣泡一旦處于芯片外的大氣壓力下，往往會(huì)不太穩(wěn)定，這在一定程度上導(dǎo)致了氣泡的破裂。

最后，該團(tuán)隊(duì)測(cè)試了2D氣泡梯度打印的能力，以更好的實(shí)現(xiàn)在3D梯度打印的需求。團(tuán)隊(duì)使用了直接適用于vFF芯片的快速數(shù)字控制，因此可以連續(xù)不中斷的打印氣泡。大型氣泡是用50μL min-1的flow rate和pg = 250 mbar和pv =大氣壓力制備的；中型氣泡的壓力降低到pg = 100 mbar；小型氣泡壓力pv額外增加到2.25bar，以縮小vFF芯片的孔口。在墨水交聯(lián)后，團(tuán)隊(duì)觀察到高度均勻的圓形氣泡，其中大部分是六角填充對(duì)齊。

綜上，該團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果證明，該設(shè)備可以在參數(shù)不變的情況下打印復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)并在其中生成大小可控的氣泡。同時(shí)，它具有梯度連續(xù)打印的能力。

圖4

四、3D打印的可行性驗(yàn)證
該團(tuán)隊(duì)通過使用自上而下的DLP打印機(jī)，進(jìn)行了復(fù)雜程度遞增的幾何形狀的3D打印。并且驗(yàn)證了將打印結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)基中浸泡14天后其結(jié)構(gòu)完整性仍然能夠維持，而不會(huì)出現(xiàn)明顯的變形。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)也指出了如空間分辨率較低和打印結(jié)構(gòu)表面不平整等一些缺陷。

之后，該團(tuán)隊(duì)使用共聚焦熒光顯微鏡與羅丹共軛fGelMA檢查了多孔結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)。分析顯示孔隙呈最密六邊形排列，且大多數(shù)生成的孔隙已經(jīng)在3D排列中相互連接。之后該團(tuán)隊(duì)對(duì)小、中、大孔徑的樣本進(jìn)行了μCT重建，這些結(jié)構(gòu)相比于共聚焦熒光顯微鏡的結(jié)果顯示孔隙度有所減少，該團(tuán)隊(duì)也給出了他們的猜想：一方面，在3D打印時(shí)，打印過程中表面張力和其他操作可能導(dǎo)致形成缺陷，導(dǎo)致泡沫墨水中的氣泡不完全緊密包裝。另一方面，在μCT掃描準(zhǔn)備樣品期間的處理可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)受到外部力量的影響。

綜上，該團(tuán)隊(duì)證明，盡管3D打印還存在一些缺陷，但生成的多孔結(jié)構(gòu)是精確可調(diào)節(jié)的。3DDLP打印方法能夠生產(chǎn)具有良好均勻性、范圍更廣泛可實(shí)現(xiàn)直徑以及更可控和更快的工藝的孔徑。

表1 3D打印的最終參數(shù)匯總

圖5 驗(yàn)證3D可打印性的打印結(jié)構(gòu)

五、細(xì)胞相容性的測(cè)試
當(dāng)涉及到組織工程和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用時(shí)，3D打印的多孔水凝膠結(jié)構(gòu)與種子細(xì)胞的細(xì)胞相容性對(duì)于組織替換至關(guān)重要。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)通過各種染色方法對(duì)細(xì)胞活力、增殖、遷移和傳播進(jìn)行了定性研究。

細(xì)胞首先在3D打印的多孔結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)了14天，并在1、3、7、10和14天進(jìn)行活/死檢測(cè)以及F-肌動(dòng)蛋白/核染色。在整個(gè)14天的栽培期中，團(tuán)隊(duì)觀察到死細(xì)胞的百分比都很低，同時(shí)，也在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從聚集成簇變?yōu)閿U(kuò)散到占據(jù)支架的大部分。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)證明了支架具有良好的生物相容性。

圖6 支架細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)測(cè)試

總結(jié)
該實(shí)驗(yàn)了將自上而下的DLP打印機(jī)與基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片結(jié)合，建立了強(qiáng)大的打印流程，并使用細(xì)胞染色分析進(jìn)行了細(xì)胞相容性測(cè)試，結(jié)果表明，多孔結(jié)構(gòu)可以在14天內(nèi)支持細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)散、增殖和遷移。由于其物理化學(xué)特性，fGelMA作為DLP打印的油墨材料受到青睞。在材料選擇中，選擇了7.5%（w/v）的水溶液fGelMA溶液，1%（w/v）的卵磷脂作為表面活性劑，1%（w/v）的LAP濃度作為光引發(fā)劑。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)通過調(diào)整油墨流量和氣體壓力、閥門大小，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氣泡尺寸的控制，當(dāng)前研究顯示的均勻直徑從大到747微米到小到143微米不等�？傮w而言，該實(shí)驗(yàn)成功地在水凝膠基質(zhì)中生成了可調(diào)大小的均勻氣泡，以制造細(xì)胞兼容的多孔支架。

參考文獻(xiàn)
(Philipp Weber, Ling Cai et al. 2023)

Philipp Weber, Ling Cai, Francisco Javier Aguilar Rojas, Carlos Ezio Garciamendez-Mijares et al. Microfluidic bubble-generator enables digital light processing 3D printing of porous structures, Aggregate, 2023.

https://doi.org/10.1002/agt2.409