增加生物墨水異質(zhì)性，提高3D打印質(zhì)量和細(xì)胞活力

來源： EngineeringForLife

生物打印是一種不斷發(fā)展的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的通用技術(shù)。理想的生物墨水具有復(fù)雜的微環(huán)境，可以模擬人體組織，允許良好的打印質(zhì)量，并提供打印后的高細(xì)胞活力。近日，來自德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院的Bruna R Maciel及其團(tuán)隊(duì)提出了兩種在1-100μm長(zhǎng)度尺度上增強(qiáng)明膠生物墨水的異質(zhì)性，從而獲得良好的打印質(zhì)量和高細(xì)胞活力的策略。利用多粒子跟蹤微流變學(xué)對(duì)膨脹水凝膠異質(zhì)性進(jìn)行全面的空間和微觀力學(xué)表征。當(dāng)將聚（乙烯醇）加入到均勻的明膠凝膠中時(shí)，由于微相分離而形成粘性夾雜物。這一現(xiàn)象導(dǎo)致了復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)的明顯滑移和良好的打印質(zhì)量，以及由于減少擠壓過程中的剪切損傷，人肝細(xì)胞癌（HepG2）和正常的人真皮成纖維細(xì)胞（NHDF）具有高細(xì)胞活力。聚合物/納米粘性團(tuán)簇的形成降低凝膠斷裂的臨界應(yīng)力，從而促進(jìn)擠壓，進(jìn)而提高打印質(zhì)量和細(xì)胞活力。通過微相分離在生物墨水中靶向引入微異質(zhì)性是一種對(duì)具有高細(xì)胞活力的復(fù)雜結(jié)構(gòu)高分辨率3D打印的有效技術(shù)。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Targeted micro-heterogeneity in bioinks allows for 3D printing of complex constructs with improved resolution and cell viability”為題于2023年8月21日發(fā)表在《Biofabrication》。

圖1 細(xì)胞活力改善和生物墨水中微異質(zhì)性引入之間的聯(lián)系示意圖

在擠壓打印過程中，剪切力和細(xì)胞損傷之間存在明確關(guān)系。在擠壓過程中，保護(hù)活細(xì)胞免受剪切變形和應(yīng)力的影響，從而提高細(xì)胞存活率的策略包括形成塞狀流或減少生物墨水的粘性變形（圖1）。在本研究中，限制攜帶材料和活細(xì)胞之間的剪切力轉(zhuǎn)移方法包括有針對(duì)性地引入生物墨水中的微異質(zhì)性（圖1）。

圖2 微異質(zhì)性特征

從MPT視頻序列中獲得的500張圖像生成的疊加圖像顯示，純明膠是一種均勻的水凝膠，示蹤劑顆粒均勻地分散在6G樣品中（圖2A）。通過添加第二種聚合物（PVA），出現(xiàn)了離散孔狀?yuàn)A雜物形式的非均勻微觀結(jié)構(gòu)（圖2B、C中的白色或綠色區(qū)域）。在白光顯微鏡獲得的圖像中可以觀察到圓形的夾雜體（圖2F，6G2P樣品）。檢測(cè)到的均方位移（MSDs）與時(shí)間無關(guān)，表明所有示蹤劑都嵌入在明膠凝膠提供的彈性基質(zhì)環(huán)境中，所有成分的局部彈性在10-25Pa范圍內(nèi)（圖2G）。為了用PVA來表征凝膠的空隙空間，用注射器將示蹤劑顆粒直接注入到內(nèi)含物中（圖2H）。MSDs隨時(shí)間呈線性變化（圖2I），表明示蹤粒子在周圍材料中自由擴(kuò)散。第二種策略是加入納米硅酸鹽顆粒（Laponite-XLG XR），誘導(dǎo)形成密集排列的微異質(zhì)性（圖2D、E）。

圖3 宏觀流變學(xué)特征：滑移、剪切誘導(dǎo)的斷裂和彈性

視頻快照顯示，當(dāng)壓縮樣品時(shí)，聚合物溶液從凝膠中釋放出來（圖3A）。這種液相也導(dǎo)致樣品在高剪應(yīng)力下脫離平行板的幾何形狀，顯示了樣品6G4P在旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)量過程中明顯的壁面滑移行為（圖3B）。在純明膠凝膠和明膠/合成鋰皂石復(fù)合材料（6G、6G0.2L、6G0.4L）中沒有觀察到這種明顯的滑移行為，在壓縮過程中沒有發(fā)生液體溢出（圖3F）。在高剪應(yīng)力下會(huì)導(dǎo)致凝膠斷裂（圖3G)。6G、6G0.2L和6G0.4L凝膠的臨界滑移應(yīng)力值非常相似，τ s約為1000Pa（圖3C）。在給定的剪應(yīng)力下可以觀察到明顯的滑動(dòng)行為，這些凝膠的滑動(dòng)速度大約比純明膠和混合凝膠高2個(gè)數(shù)量級(jí)（圖3D）。圖3E所示的凝膠和混合明膠/合成鋰皂石凝膠（樣品6G、6G0.2L、6G0.4L）的表觀粘度曲線非常相似，表明合成鋰皂石聚集體不影響凝膠的表觀流動(dòng)行為。單軸壓縮試驗(yàn)顯示，與純凝膠和PVA樣品相比，合成鋰皂石凝膠的楊氏模量E明顯下降（圖3I）。本研究中提出的兩種微觀異質(zhì)性形成策略的剪切彈性模量G0均有所增加（圖3J）。

圖4 擠壓生物打印（EBB）：打印質(zhì)量評(píng)價(jià)

當(dāng)打印2D結(jié)構(gòu)時(shí)，所有的凝膠都顯示出原木樁幾何形狀（線寬< 1.5 mm）的高形狀保真度（圖4A-E）。一小部分粘性液滴或致密的粒子簇顯示出明顯改善、更薄的線質(zhì)量（線寬< 0.6 mm，圖4F）。人耳3D模型是一個(gè)復(fù)雜的物體，形狀呈圓形，比簡(jiǎn)單的網(wǎng)格幾何形狀顯示出更多的細(xì)節(jié)（圖4G）。用樣品6G2P在載玻片上方4mm處成功打印出了約58°的獨(dú)立耳螺旋突出部分（圖4H）。所有的打印結(jié)構(gòu)都顯示了高彈性剪切模量提供的機(jī)械穩(wěn)定性（圖4I）。

圖5 3D生物打�。杭�(xì)胞活力

圖6 3D生物打�。杭�(xì)胞活力

活/死試驗(yàn)顯示（圖5A-G），PVA水凝膠在第1天細(xì)胞活力高（圖5D），而均質(zhì)純明膠水凝膠的活力明顯較低。用水凝膠復(fù)合材料打印，細(xì)胞活力大于65%（圖5H-K）。第1天嵌入HepG2細(xì)胞的樣品顯示在粘合玻片上的四層原木樁結(jié)構(gòu)（圖5L）。在樣品6G、6G2P和6G0.2L中可以看到打印出的交叉區(qū)域的細(xì)節(jié)（圖5M-O）。

以四層原木樁幾何形狀打印水凝膠，并在第1天分析細(xì)胞活力，以評(píng)估對(duì)3D打印的直接影響（圖6A-C）和細(xì)胞培養(yǎng)7天的影響（圖6E-G）。第1天，6G水凝膠細(xì)胞活力小于80%，而6G2P和6G0.2L凝膠的細(xì)胞活力大于85%（圖6D）。第7天所有凝膠的細(xì)胞表現(xiàn)出相似的伸長(zhǎng)。NHDF細(xì)胞更集中在水凝膠的邊緣，所有樣品的活力均大于90%。圖6H中為樣品6G2P打印在粘接玻片上的四層原木樁支架，在第1天嵌入NHDF細(xì)胞。樣品6G2P第1天和第7天的打印的交叉區(qū)域以及絲之間的空隙區(qū)域的細(xì)節(jié)如圖6I-L所示。綜上所述，本研究開發(fā)了兩種不同的具有定制微異質(zhì)性的明膠生物墨水，可以制造復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，并顯著提高打印質(zhì)量和細(xì)胞活力。

在本研究中，具有微異質(zhì)性的水凝膠允許在沒有支撐材料的室溫下3D打印獨(dú)立的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞培養(yǎng)7天后提供較高的NHDF細(xì)胞活力。MPT的微觀結(jié)構(gòu)表征可以為活細(xì)胞的3D打印提供良好的微環(huán)境條件。通過誘導(dǎo)明膠網(wǎng)絡(luò)中粘性孔狀內(nèi)含物或聚合物-納米粘性相互作用引起的微異質(zhì)性形成來調(diào)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)于打印質(zhì)量和支持細(xì)胞3D打印的微環(huán)境發(fā)展具有重要意義。引入微異質(zhì)性的概念以一種直接的方式轉(zhuǎn)移到其他水凝膠系統(tǒng)中，從而刺激進(jìn)一步的策略發(fā)展，以提高打印質(zhì)量和細(xì)胞活力。

文章來源：https://orcid.org/0000-0001-7837-2582