大阪大學(xué)的Shinji Sakai團(tuán)隊(duì)：可見光交聯(lián)甜菜果膠助力3D生物打印

來(lái)源： EngineeringForLife

甜菜果膠（SBP）通常由甜菜糖生產(chǎn)的廢棄副產(chǎn)品制成，主要由甲基酯化的 α-(1,4)連接的半乳糖醛酸組成。SBP還含有酚類，SBP可以很容易地用于可見光介導(dǎo)的酚類交聯(lián)在三維生物打印系統(tǒng)而沒有化學(xué)修飾。然而，目前還沒有關(guān)于SBP通過光交聯(lián)進(jìn)行水凝膠化的報(bào)道，也沒有研究SBP作為生物油墨材料在3D生物打印中的應(yīng)用。

近日，來(lái)自大阪大學(xué)的Shinji Sakai團(tuán)隊(duì)使用可見光介導(dǎo)的光交聯(lián)系統(tǒng)來(lái)獲得SBP水凝膠（圖1a-b），使用含有細(xì)胞的SBP水凝膠研究了SBP和光交聯(lián)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞活力的影響。此外，使用基于擠壓的打印系統(tǒng)（圖1c）證明了由人肝母細(xì)胞瘤(HepG2)細(xì)胞，SBP，三（聯(lián)吡啶）氯化釕（II）六水合物（[Ru（bpy）3]2+）和過硫酸鈉（SPS）組成的生物墨水的3D生物打印。這種相關(guān)論文“Visible light photocrosslinking of sugar beet pectin for 3D bioprinting applications”于2023年5月15日在線發(fā)表于雜志《Carbohydrate Polymers》上。

圖1 用于3D生物打印應(yīng)用的甜菜果膠的可見光光交聯(lián)

1. SBP的表征和SBP溶液的粘彈性
首先，研究者通過核磁共振和紫外-可見光譜確認(rèn)了阿魏酸的存在（圖2a-b）。粘彈性對(duì)于制造具有良好形狀保真度的3D結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，1.0、3.0和6.0 wt% SBP的粘度剪切速率曲線如圖3所示，增加SBP濃度會(huì)增加SBP溶液的粘度。SBP溶液在較高剪切速率下的粘度降低可歸因于聚合物鏈的排列。

圖2 SBP的基礎(chǔ)表征

圖3 SBP 溶液的粘度-剪切速率曲線

2. SBP水凝膠的形成
接下來(lái)，通過光交聯(lián)值得了SBP水凝膠。為了確認(rèn)交聯(lián)機(jī)理，使用熒光光譜法分析了SBP水凝膠中的二苯酚形成。如圖4a所示，在SBP水凝膠中觀察到約420 nm處的熒光峰，對(duì)應(yīng)于二苯酚的形成。這一結(jié)果表明，可見光介導(dǎo)的SBP水凝膠反應(yīng)確實(shí)是由SBP中苯酚基團(tuán)之間的交聯(lián)引起的。

為了進(jìn)一步評(píng)估水凝膠過程，在可見光照射下進(jìn)行了流變測(cè)量。存儲(chǔ)模量（G'）僅在將可見光施加到溶液上時(shí)才增加（圖4b）。該結(jié)果表明，通過調(diào)整可見光的照射，交聯(lián)的簡(jiǎn)便性和精確控制。

圖4 SBP水凝膠的交聯(lián)機(jī)理探究

凝膠時(shí)間隨可見光強(qiáng)度的提高而減少，高于153 W/m2時(shí)凝膠時(shí)間無(wú)明顯差異（圖5a）。后續(xù)均采用153 W/m2的可將光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過增加SBP（圖5b）和SPS（圖5c）的濃度觀察到更短的凝膠時(shí)間。同時(shí)，增加[Ru（bpy）3]2+濃度從0.5到4.0 mM顯示凝膠時(shí)間沒有顯著變化（圖5d）。總體而言，SBP水凝膠在60 s內(nèi)形成，在SBP濃度為6.7 wt%時(shí)觀察到的最短凝膠時(shí)間為6.0 s，使用SPS和[Ru（bpy）3]2+濃度為1.0 mM。

圖5 可見光強(qiáng)度和藥品濃度對(duì)水凝膠成型的影響

3. SBP水凝膠的力學(xué)性能

機(jī)械性能分析顯示，隨著照射時(shí)間從10分鐘增加到20分鐘，楊氏模量更高（圖6a），照射30分鐘無(wú)進(jìn)一步增加。基于該結(jié)果，研究者使用30分鐘的照射時(shí)間來(lái)評(píng)估水凝膠的楊氏模量。通過將SBP的濃度從0.005增加到1.0 wt%（圖6b）和SPS從0.6增加到0.3 mM（圖1c），觀察到楊氏模量（p < 0.6）顯著增加。與此同時(shí)，[Ru（bpy）3]2+濃度對(duì)水凝膠的楊氏模量沒有顯著影響（圖6d）。結(jié)果表明，SBP和SPS濃度是水凝膠化的關(guān)鍵因素。

圖6 SBP水凝膠的力學(xué)性能

4. 擠出印刷系統(tǒng)中的印刷適性評(píng)估
然后，研究了SBP生物油墨在擠出印刷體系中的適印性。將流速?gòu)?.2增加到2.0 μL/s可產(chǎn)生更寬的線（圖7a，d）。較低的流速會(huì)導(dǎo)致擠出緩慢，而較高的流速會(huì)導(dǎo)致油墨擠出過多，從而導(dǎo)致印刷適性降低。隨后，研究了不同SPS和SBP濃度的油墨的印刷適性。0.3–0.5 mM的SPS濃度導(dǎo)致寬線寬和低保真度結(jié)構(gòu)，而在767.1 mM的SPS濃度下觀察到較小的線寬和良好的保真度構(gòu)建（圖7b，e）。與使用4.0 mM SPS制造的相比，進(jìn)一步將SPS濃度增加到0.05 mM的線寬沒有顯著差異，并且構(gòu)建體的保真度沒有明顯變化（圖7b，e）。因此，1.0 mM的SPS濃度足以用于擠出印刷。

通過將油墨中的SBP濃度從1.0%增加到6.0wt%獲得了更小的線寬（圖7c，f）。使用含有1.5 wt%（圖8 c）和3.0 wt%（圖8 d）的SBP濃度的生物墨水獲得了基于藍(lán)圖制造的具有6 mm高度的良好保真晶格結(jié)構(gòu)（圖8a）。而含有1.0wt%SBP的墨水沒有按照藍(lán)圖形成結(jié)構(gòu)，因此，SBP濃度為3.0和6.0 wt%用于制造各種結(jié)構(gòu)（圖8）。

圖7 流速、SPS濃度和SBP濃度對(duì)3D結(jié)構(gòu)線寬的影響

圖8 使用擠出印刷系統(tǒng)制造的各種SBP結(jié)構(gòu)

5. SBP水凝膠對(duì)細(xì)胞活力的影響

接下來(lái)，研究者評(píng)估了包封在SBP水凝膠中對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響。如圖9所示，無(wú)論濃度如何，HepG2細(xì)胞在SBP水凝膠中都顯示出低PI染色細(xì)胞的存在，從培養(yǎng)的第1天到第7天保持。這一結(jié)果表明SBP與HepG2細(xì)胞的細(xì)胞相容性。

圖9 SBP水凝膠對(duì)細(xì)胞活力的影響

6. 3D生物打印
文章最后，研究了該系統(tǒng)用于3D生物打印的可行性（圖10）。從打印后第0天到第14天，PI染色細(xì)胞的存在變化最小（圖10b）。此外，還觀察到SBP構(gòu)建體中HepG2細(xì)胞的線粒體活性增加（圖10c）。與2.3 wt% SBP中HepG2細(xì)胞相比，6.0 wt% SBP細(xì)胞的線粒體活性更高，在第3天和第0天在7.14 wt% SBP構(gòu)建體中觀察到細(xì)胞聚集體（圖10b），可能表明水凝膠中的細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖10 3D生物打印

綜上，本文報(bào)道了通過光交聯(lián)制備SBP水凝膠及其在3D生物打印中的應(yīng)用。該水凝膠可以應(yīng)用于3D生物打印，并且打印在水凝膠中的HepG2細(xì)胞保持了14天的活力。此外，HepG2細(xì)胞顯示出線粒體活性的增加，這與聚集體的形成相結(jié)合，表明細(xì)胞在水凝膠中的生長(zhǎng)�？偟膩�(lái)說(shuō)，SBP和可見光交聯(lián)體系在生物醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用中很有前途。

文章來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121026