《Bioactive Materials》：3D打印支架功能再革新，為促進(jìn)骨再生提供微環(huán)境

來源： EngineeringForLife


三維（3D）打印技術(shù)正在推動(dòng)包括組織工程在內(nèi)的各個(gè)工程領(lǐng)域的進(jìn)步。然而，原始的3D打印支架通常缺乏強(qiáng)大的功能來刺激各種再生應(yīng)用所需的活動(dòng)。近日，來自美國(guó)羅切斯特大學(xué)的Lichun Lu團(tuán)隊(duì)將二維(2D)異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素4(IL-4)細(xì)胞因子相結(jié)合，用于3D打印支架的功能化，以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)愈合的免疫微環(huán)境，以優(yōu)化骨損傷維修（圖1）。在大鼠體內(nèi)植入后，具有免疫功能的 3D 支架通過構(gòu)建促愈合免疫微環(huán)境實(shí)現(xiàn)體內(nèi)骨免疫調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)缺損區(qū)域的血管生成和成骨，從而促進(jìn)骨再生。這些結(jié)果表明，具有二次加載免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的3D支架的免疫功能化是改善骨再生的令人鼓舞的策略。相關(guān)論文“3D-printed scaffolds with 2D hetero-nanostructures and immunomodulatory cytokines provide pro-healing microenvironment for enhanced bone regeneration”于2023年4月13日在線發(fā)表于雜志《Bioactive Materials》上。

圖1 具有2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的3D打印支架的制備及使用示意圖

1. 異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的表征
首先，研究者合成了由氧化石墨烯（GO）層和黑磷（BP）納米片組成的2D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)。TEM和SEM證實(shí)了超聲處理后尺寸范圍為納米級(jí)的小BP納米片的產(chǎn)生（圖2a），AFM表明剝落的BP納米片具有多層結(jié)構(gòu)（圖2b）。TEM圖像證實(shí)了氧化和剝落后GO納米片的產(chǎn)生（圖2c），AFM測(cè)試檢測(cè)到高度約為1-2 nm（圖2d）。將GO納米片和BP納米片混合后，得到含有兩層二維材料的異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)。TEM圖像表明BP納米片與GO納米片均勻分布（圖2e），GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的詳細(xì)可視化表明，BP納米片被大面積GO層完全包裹。這些表征表明，BP納米片和GO納米片這兩種類型的二維材料并不相互排斥，因此可以成功地應(yīng)用于形成異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)（圖2f）。

圖2 異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)及3D支架的表征

2. 3D聚合物支架的印刷與功能化
然后，作者在Bio-X打印機(jī)上打印了聚合物1D支架（圖2g），將得到的3D支架浸入具有各種2D材料的溶液中，即GO納米片，BP納米片和GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行表面功能化（圖2h）。具有3D GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的2D支架在深色的表面上顯示出基本的2D材料（圖2i）。3D支架的SEM顯微鏡在納米尺度上顯示了聚合物支架表面2D材料的相應(yīng)特征（圖2k-l）。在涂覆一層2D BP納米片后，得到的3D-Scaf-BP支架具有隨機(jī)分散在表面上的BP納米片涂層，如圖2l中的綠色所示。此外，BP納米片可以通過與氧氣和水反應(yīng)緩慢氧化，以連續(xù)釋放磷酸根離子（圖2m）。

3. 干細(xì)胞增殖和成骨
2D材料功能化3D支架的生物相容性對(duì)于體內(nèi)植入至關(guān)重要�；�/死染色和浸出培養(yǎng)基對(duì)共培養(yǎng)干細(xì)胞的活力實(shí)驗(yàn)表明，功能化的3D支架對(duì)干細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，也不會(huì)向培養(yǎng)基釋放有毒物質(zhì)，因此具有生物相容性，適用于體外細(xì)胞研究和體內(nèi)植入。增殖實(shí)驗(yàn)表明，干細(xì)胞在所有4種類型的3D支架上都顯示出生長(zhǎng)趨勢(shì)，類似于TCPS對(duì)照（圖3c），重建的3D掃描共聚焦圖像顯示大量干細(xì)胞粘附在3D支架的頂部和內(nèi)部脊上（圖3d），干細(xì)胞的SEM圖像與未功能化的純2D支架相比，3D納米片上的豐度細(xì)胞和異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)功能化的3D支架顯示出一致的趨勢(shì)（圖3e）。與干細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，通過免疫熒光染色可視化成骨制造蛋白OPN的表達(dá)。結(jié)果表明，2D GO納米片和功能化支架釋放的磷酸根離子可以促進(jìn)細(xì)胞成骨（圖3f-h）。

圖3 干細(xì)胞在支架上的行為

4. 3D 支架的免疫功能和巨噬細(xì)胞反應(yīng)
將未功能化的純3D支架和2D材料功能化的3D支架全部浸入大鼠IL-4溶液中以吸收IL-4細(xì)胞因子（圖4a）。結(jié)果表明，用GO或GOBP異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)的3D支架上的IL-3負(fù)載量含量更高（圖4b-c）。在接種3、12和24小時(shí)后測(cè)試骨髓來源巨噬細(xì)胞（rBMDM）對(duì)滅菌的免疫功能72D支架的粘附，結(jié)果表明：3D-Scaf-GOBP-免疫支架具有最多的巨噬細(xì)胞數(shù)量，顯示出巨噬細(xì)胞吸引和增殖的最佳特性（圖4d），免疫熒光圖像顯示出一致的結(jié)果（圖4e）。巨噬細(xì)胞表型變化結(jié)果顯示，通過異質(zhì)納米層改進(jìn)的IL-3細(xì)胞因子負(fù)載和釋放可以在粘附在3D支架上實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的有效表型極化（圖4f-j）。

圖4 免疫功能化和巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變

5. 巨噬細(xì)胞對(duì)血管形成和成骨的影響
為了探索巨噬細(xì)胞響應(yīng)免疫功能3D支架是否會(huì)影響鄰近細(xì)胞的血管形成和成骨，將巨噬細(xì)胞的釋放培養(yǎng)基與HUVEC和rBMSC共培養(yǎng)（圖5a）。如圖5b-f所示，不同基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量不同。在與免疫功能化3D支架的IL-3細(xì)胞因子誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上層共培養(yǎng)的HUVECs中檢測(cè)到血管基因表達(dá)較高的總體趨勢(shì)。對(duì)于成骨分析，顯示與血管標(biāo)志物相似的趨勢(shì)，其中檢測(cè)到由3D-Scaf-GOBP-免疫支架浸出培養(yǎng)基誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上消化母共培養(yǎng)的rBMSC的最高值（圖5i-m）。

圖5 體外血管形成和成骨

6. 3D免疫支架的體內(nèi)骨再生
在骨缺損部位，損傷微環(huán)境生態(tài)位涉及各種細(xì)胞和因素（圖6a）。創(chuàng)建直徑為5 mm的全層骨缺損，并將3D支架植入缺損中（圖6b）。4周后，收獲顱骨碎片以分析骨形成（圖6c-d）。如圖6e所示，顯微CT圖像表明，植入3D支架的缺損部位內(nèi)的新骨形成更顯著，空對(duì)照的新骨形成最少。對(duì)于用3D材料功能化的三種類型的2D支架，沿著缺陷邊緣形成了小規(guī)模的完整骨塊（圖6e）。此外，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子負(fù)荷可進(jìn)一步加速骨形成（圖6f-h）。主要器官的HE染色表明，本研究中使用的3D支架在體內(nèi)條件下具有生物相容性，與體外細(xì)胞評(píng)估一致（圖6i）。

圖6 免疫功能支架的體內(nèi)骨形成

7. 體內(nèi)新生血管形成和成骨
為了評(píng)估在顱骨缺損部位植入的3D支架的骨修復(fù)，收獲的骨組織在嵌入石蠟后進(jìn)行脫鈣和切片。圖7a-c顯示，3D支架可以橋接骨缺損，并為細(xì)胞在骨缺損區(qū)域進(jìn)行和分配提供優(yōu)異的組織導(dǎo)電性。CD31和ALP表明支架植入促進(jìn)了細(xì)胞募集和組織形成（圖7d），熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果也與之相符（圖7e-f）。

圖7 大鼠顱骨缺損模型中的免疫組織學(xué)分析和體內(nèi)新生血管和成骨

8. 體內(nèi)M2巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)
為測(cè)定骨缺損體內(nèi)巨噬細(xì)胞募集和M2表型極化，對(duì)顱骨進(jìn)行CD68和CD206免疫熒光雙染色。對(duì)于3D-Scaf-GOBP，在組織內(nèi)觀察到CD68和CD206熒光的廣泛分布，表明異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的功能可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)3D支架的募集（圖8a），定量計(jì)算與熒光圖像一致（圖8b-c）。CD206熒光的體內(nèi)分布表明了偏振M2巨噬細(xì)胞的位置，對(duì)于這些3D支架來說是獨(dú)一無二的（圖8a）。觀察到有效的CD206熒光包圍植入的3D支架脊，表征了CD206熒光強(qiáng)度與到支架脊表面的距離的關(guān)系（圖8d）。

圖8 體內(nèi)巨噬細(xì)胞表型表征

綜上，本文通過結(jié)合3D異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)IL-2細(xì)胞因子，成功構(gòu)建了免疫功能化的3D支架，并通過創(chuàng)建促愈合的免疫微環(huán)境優(yōu)化了體內(nèi)骨損傷修復(fù)。體外測(cè)試表明，由GO和BP納米片組成的二維異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)可以提高細(xì)胞粘附，磷酸根離子的持續(xù)釋放刺激細(xì)胞增殖和成骨。二維異質(zhì)納米層還增加了免疫調(diào)節(jié)IL-2細(xì)胞因子的負(fù)載量，并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化為M2表型，以構(gòu)建有利于愈合的免疫微環(huán)境，以改善血管生成和成骨。體內(nèi)植入結(jié)果表明，免疫功能化的3D支架橋接損傷缺陷，增強(qiáng)細(xì)胞募集，并通過磷酸鹽的持續(xù)釋放刺激體內(nèi)新生血管和成骨作用。負(fù)載的IL-2細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)了巨噬細(xì)胞極化為M3表型，這可能有助于建立促進(jìn)愈合的微環(huán)境以加速骨損傷恢復(fù)。因此，具有免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子二次加載的2D GOBP異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)的3D支架的免疫功能化可以為3D打印的支架提供支持快速骨損傷恢復(fù)的有希望的策略。



文章來源：

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.021