美國賓夕法尼亞大學：調(diào)整灰白質(zhì)比即可輕松模仿脊髓機械異質(zhì)性

來源：EngineeringForLife

生物工程支架具有模擬組織機械性能的特質(zhì)，但天然組織的機械性能通常是不均勻的且難以表征，特別是脊髓的神經(jīng)特性。遞送到受傷脊髓以刺激軸突連接的支架通常使用沿著頭-尾軸的引導線索匹配天然組織的各向異性，但是當前的方法沒有模擬宿主組織力學的異質(zhì)性�；�于此，來自美國賓夕法尼亞大學的Paul A. Janmey團隊描述了一種修改DLP打印支架的方法，該支架模擬由白質(zhì)和灰質(zhì)比例變化引起的脊髓機械異質(zhì)性，與表現(xiàn)出均勻機械特性的對照組相比，這種方法能夠有效改善軸突浸潤。

相關(guān)研究成果以“Matching mechanical heterogeneity of the native spinal cord augments axon infiltration in 3D-printed scaffolds”為題于2023年2月16日發(fā)表在《Biomaterials》上。

1. 脊髓力學性能的微結(jié)構(gòu)表征
為了檢查脊髓組織的異質(zhì)性，作者首先進行了使用AFM和張力計的初步實驗，以詢問沿著橫向解剖平面的灰質(zhì)和白質(zhì)的差異。為了澄清這些研究之間的差異，對脊髓進行了AFM和張力測量實驗(圖1A-B)。將組織分為三個區(qū)域：骶骨、胸/腰椎和頸椎，以評估解剖水平是否影響脊髓的機械性能。AFM以前已經(jīng)被用來表征脊髓力學，顯示灰質(zhì)比白質(zhì)表現(xiàn)出顯著更高的彈性模數(shù)，盡管在三個水平之間沒有統(tǒng)計學差異(圖1C)。圖1D顯示了所有三個區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)的松弛因子，雙因素方差分析顯示灰質(zhì)和白質(zhì)之間存在統(tǒng)計學差異，盡管水平之間沒有差異。這些結(jié)果表明，與白質(zhì)相比，灰質(zhì)表現(xiàn)出更堅硬和更多的粘彈性力學，并且灰質(zhì)和白質(zhì)沿脊髓長度的微觀結(jié)構(gòu)力學性質(zhì)沒有差異。為了驗證這種力學異質(zhì)性也存在于大鼠脊髓內(nèi)，對大鼠脊髓頸部水平的切片進行了原子力顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)灰質(zhì)區(qū)域的彈性模數(shù)明顯高于周圍白質(zhì)區(qū)域。

圖1 牛脊髓組織的微結(jié)構(gòu)力學特性

之后流變學被用來描述頸椎、腰椎和骶骨水平的脊髓的體積力學特征。對來自三個獨立牛脊髓的每個水平(頸椎、腰椎和骶椎)的三個不同切片進行了流變學檢測。給定AFM測試的結(jié)果，這些實驗測試了這樣的假設(shè)，即解剖層面的整體力學性質(zhì)的差異是由于灰質(zhì)與白質(zhì)的比例不同。因此，在取自不同水平的5-6 mm厚的脊髓橫切面上測量了剪切儲能和損耗模量以及灰質(zhì)和白質(zhì)的橫截面積。圖2A-C顯示了在三種不同的牛脊髓上進行的流變學實驗。其中兩只動物的頸部和第三只動物的骶部測得了最高的存儲和損失模數(shù)。為了使整體測試與AFM測量結(jié)果一致，即在脊髓的灰質(zhì)或白質(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)差異，脊髓橫切面(圖2D-F)，橫切面中灰質(zhì)的百分比表示為總面積的百分比(圖2G-I)。這些結(jié)果表明，沿臍帶的整體流變特性是由臍帶橫截面中灰質(zhì)與白質(zhì)的比率的差異決定的。

圖2 脊髓組織宏觀結(jié)構(gòu)力學特性的表征

2. 灰質(zhì)和白質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)分析
為了深入了解導致機械異質(zhì)性的灰質(zhì)和白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)差異，采用免疫組織化學方法檢測了沿脊髓不同水平的兩個區(qū)域的細胞核、髓鞘和層粘連蛋白表達的差異。圖3顯示了頸椎、腰椎和腰椎在開始處固定的切片(圖3A、C、E)，并在6小時后結(jié)束(圖3B、D、F)的力學表征實驗。DAPI、髓磷脂和層粘連蛋白的定量分析表明在所有水平的白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)域之間存在顯著差異。

圖3 灰質(zhì)和白質(zhì)的免疫組織化學分析

3. 具有不同機械性能的3D打印支架
基于以上結(jié)果，作者開發(fā)了一種新的DLP方法來制造支架，該支架模擬了通過牛脊髓微結(jié)構(gòu)力學測試觀察到的灰色和白色區(qū)域之間的硬度差異（圖4A）。作者創(chuàng)建了灰度圖案以在0-100%之間改變光強值，代表黑色到白色，以調(diào)節(jié)GelMA水凝膠的聚合程度。為了驗證這種方法，交替強度的測試圖案被打印在正方形塊中。圖4B顯示了用于這些初步打印的灰度掩模，在10x10x3 mm的塊中具有1 mm厚的條紋，用張力計量法驗證力學性能的差異。對這些數(shù)據(jù)的量化和隨后的統(tǒng)計分析表明，每條條紋之間存在顯著差異，表明暴露在高光強下的區(qū)域表現(xiàn)出比低光強區(qū)域更堅硬的力學性能(圖4C)。這些結(jié)果驗證了3D打印支架可以實現(xiàn)異質(zhì)性，以模擬灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域之間的硬度差異。

圖4 3D打印支架的特點

4. 脊髓損傷三維打印支架的力學特性研究
在驗證了具有異質(zhì)機械性能的3D打印支架的方法后，水凝膠被打印出來以模仿大鼠T10幾何形狀。圖5A顯示了同質(zhì)支架（以用于異質(zhì)支架白質(zhì)的相同光強度打印）和一個異質(zhì)支架中灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域內(nèi)支架的SEM圖像。量化表明，在異質(zhì)支架的模擬灰質(zhì)中孔徑減�。▓D5B），為了進一步驗證模擬的白質(zhì)和灰質(zhì)之間的差異，對暴露于不同光強度的散裝水凝膠進行了壓縮測試。壓縮測試表明，與代表白質(zhì)的水凝膠相比，暴露于用于創(chuàng)建灰質(zhì)區(qū)域的光強度的水凝膠表現(xiàn)出明顯更高的彈性模量（圖5C）。在驗證了暴露于不同像素強度的支架的機械性能之間存在差異后，獲得了同質(zhì)和異質(zhì)支架的圖像，以證明不同的剛度不會影響支架的幾何形狀（圖5E）。圖 5F-H 顯示了均質(zhì)和異質(zhì)支架中彈性模量的熱圖，異質(zhì)支架內(nèi)的灰質(zhì)表現(xiàn)出明顯高于周圍白質(zhì)和以75%強度打印的均質(zhì)水凝膠的彈性模量。此外，異質(zhì)支架中的灰質(zhì)硬度與以100%強度打印的同質(zhì)支架之間沒有顯著差異（圖5I）�？傊�，上述結(jié)果表明機械異質(zhì)性可以在脊髓支架中實現(xiàn)。

圖5 3D打印異質(zhì)支架的特點

5. 評估軸突滲透到具有異質(zhì)機械性能的支架中
最后，作者進行移植研究以確定異質(zhì)支架與同質(zhì)對照相比是否會引起增加的軸突浸潤。異質(zhì)支架和剛度與異質(zhì)支架匹配的同質(zhì)支架都被移植到急性脊髓損傷模型中。圖6A顯示了T10支架的水凝膠制造、損傷模型和移植示意圖。異質(zhì)支架顯著增強了感覺軸突的浸潤（圖6C）。為了進一步評估軸突浸潤到支架中，檢查了移植支架的延髓和尾部區(qū)域是否存在Tuj纖維。圖6D顯示Tuj+軸突的存在僅位于支架的延髓區(qū)域，具有與異質(zhì)支架的“白質(zhì)”相匹配的均質(zhì)力學。圖6E表明與灰質(zhì)匹配的均質(zhì)支架中的類似響應。然而，在異質(zhì)支架的頭側(cè)和尾側(cè)部分均觀察到Tuj+纖維的浸潤和生長（圖6F），表明機械異質(zhì)性刺激了神經(jīng)元再生。

為了確定異質(zhì)支架是否刺激軸突生長增加，在兩種支架類型的白質(zhì)區(qū)域評估了Tuj纖維的量化，表明異質(zhì)支架顯著促進了Tuj+纖維的生長（圖6G）并刺激了浸潤與均質(zhì)水凝膠相比的距離（圖6H）。總體而言，這些結(jié)果表明，具有與宿主組織各向異性相匹配的異質(zhì)機械性能的 3D 打印支架對軸突的浸潤和再生具有有益影響。

圖6 移植后軸突浸潤的檢查

綜上，橫向脊髓部分的大量流變學測試表明，脊髓的粘彈性特性沿其長度發(fā)生變化。但不是由于微觀結(jié)構(gòu)特性的差異，AFM和張力測量表明灰質(zhì)和白質(zhì)的剛度不會根據(jù)水平而變化。因此，沿線的整體機械性能差異是由灰質(zhì)和白質(zhì)相對量的差異引起的。對現(xiàn)有數(shù)字光處理技術(shù)的修改有助于打印具有異質(zhì)機械性能的支架，提供了一種模擬灰質(zhì)和白質(zhì)之間剛度差異的方法。急性橫斷大鼠模型的移植實驗表明，與均質(zhì)機械特性相比，具有這種異質(zhì)機械特性的支架會導致更大的軸突浸潤。盡管這種差異背后的機制尚不清楚，但這些結(jié)果強調(diào)了開發(fā)模擬脊髓組織空間異質(zhì)性的生物材料的重要性。

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https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122061