《Biofabrication》：蛋清用做生物墨水？改善3D打印支架的生物學(xué)

來源： EngineeringForLife

三維微擠壓生物打印在制造具有空間定義的細(xì)胞分布的分層結(jié)構(gòu)、功能性組織替代品方面引起了極大的興趣。盡管取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但仍然存在一些重大限制，例如缺乏合適的生物墨水，這些生物墨水將有利的細(xì)胞反應(yīng)與高形狀保真度相結(jié)合。

為了解決這一局限性，來自德累斯頓工業(yè)大學(xué)的Michael Gelinsky的團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性的設(shè)計(jì)了蛋清(EW)功能化的藻酸鹽-甲基纖維素(AlgMC)混合物的新型生物墨水。生物打印的AlgMC+EW構(gòu)造表現(xiàn)出出色的形狀保真度，而封裝的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)顯示出高打印后活力以及在基質(zhì)內(nèi)的粘附和擴(kuò)散。

相關(guān)研究成果以“Egg white improves the biological properties of an alginate-methylcellulose bioink for 3D bioprinting of volumetric bone constructs”為題于2023年2月3日發(fā)表在《Biofabrication》上。

1. 不同EW濃度的低粘度Alg水凝膠中的細(xì)胞反應(yīng)
為了研究EW對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的影響，制備了六種不同的Alg水凝膠組合物，其中 Alg 含量恒定為 3%（w/v），EW 的比例從 0-100% 不等�；�于這些生物墨水的載滿細(xì)胞的圓盤狀結(jié)構(gòu)是通過擠壓沉積法制造的（圖1A）。培養(yǎng) 1 天和 7 天后，通過活/死測(cè)定評(píng)估制造的載有細(xì)胞的圓盤的細(xì)胞相容性（圖1B），各組細(xì)胞存活率均達(dá)到80%以上。由此，EW 支持的生物墨水可以促進(jìn) MSC 在基于擠壓的支架中的活力。

圖1 3D打印支架及細(xì)胞存活率

此外，與第1天相比，細(xì)胞密度有所降低（圖2A）。相比之下，在 E40-H60 組中發(fā)現(xiàn)了MSC的交錯(cuò)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，并且在孵育7天后也可以觀察到 E60-H40、E80-H20 和 E100-H20 組中的細(xì)胞附著和擴(kuò)散（圖2A），即細(xì)胞可以在用 EW 修飾的Alg生物墨水中附著和擴(kuò)散；然而，EW的濃度應(yīng)超過40%才能產(chǎn)生顯著效果。為了進(jìn)一步分析不同支架中的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)培養(yǎng)7天后的細(xì)胞面積（細(xì)胞骨架染色的覆蓋面積）進(jìn)行了定量測(cè)量（圖2C）；結(jié)果表明含有EW的Alg墨水可以促進(jìn)MSC在凝膠中的附著和擴(kuò)散，并且 EW 的量不應(yīng)低于40%。

圖2 不同EW比例的擠壓Alg生物墨水中的細(xì)胞活力

2. 探索MSC在EW支持的藻酸鹽油墨中的活力和附著力，同時(shí)增強(qiáng)MC的印刷適性
由于帶有EW的Alg墨水（3%，w/v）的低粘度不允許3D打印具有足夠形狀保真度的線以形成多孔網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，這對(duì)于生物打印結(jié)構(gòu)中的開放孔隙率是強(qiáng)制性的，因此作者混合了Alg含MC的油墨，用于增強(qiáng)粘度和印刷適性。根據(jù)之前細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果，作者選擇E40-H60和E60-H40混合物（即40%和60% EW濃度）用作生物聚合物Alg和MC的溶劑。相關(guān)制備過程示意圖如圖3A所示，將MSC添加到不同的墨水中以制備生物墨水和擠壓結(jié)構(gòu)。

之后通過評(píng)估細(xì)胞活力和形態(tài)對(duì)制備的生物墨水中的細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行初步評(píng)估。在培養(yǎng)1天和21天后，通過活/死染色評(píng)估MSC在具有不同濃度EW和MC的擠壓圓盤結(jié)構(gòu)中的生存能力（圖3B）。從這些結(jié)果得出的結(jié)論是，與不含 MC 的 Alg 凝膠相比，細(xì)胞活力隨著 MC 的添加而降低。培養(yǎng)21天后，各組均能保持較高的細(xì)胞活力；此外，作者還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以在結(jié)構(gòu)中附著和擴(kuò)散（圖 3B）。

圖3 制備過程示意圖及細(xì)胞染色的代表性熒光顯微圖像

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞形態(tài)，在培養(yǎng)1天和21天后對(duì)細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行熒光染色，捕獲的圖像如圖4A所示。60% EW組比40% EW組更成功地支持細(xì)胞生長，從細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)分析來看，具有 60% EW 的組表現(xiàn)出更好的細(xì)胞粘附和擴(kuò)散，可能是因?yàn)檫@些材料為 MSC 提供了更多的粘附位點(diǎn)和友好的微環(huán)境。根據(jù)細(xì)胞骨架染色后的顯微照片定量分析細(xì)胞面積顯示，60％EW組的細(xì)胞面積大于40％EW組(圖4C)。這些結(jié)果初步表明，具有60% EW的AlgMC生物墨水在生物打印結(jié)構(gòu)中具有良好細(xì)胞反應(yīng)，表現(xiàn)優(yōu)于40% EW組。因此，具有60% EW的AlgMC生物墨水用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同比例的MC和EW的生物打印Alg-MC-EW結(jié)構(gòu)中MSC的細(xì)胞活力

3. 流變學(xué)特性
流變學(xué)特性是對(duì)糊狀生物材料的印刷適性具有決定性影響的物理化學(xué)參數(shù)，基于開發(fā)的油墨的生物學(xué)特性評(píng)估結(jié)果，油墨組合物 60-40(3-3)、60-40(3-6) 和 60-40(3-9) 的流變學(xué)特性為通過剪切斜坡和剪切恢復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行研究。通過將 MC 濃度從 3% 增加到 9%，a在 0 到 100 s−1 的剪切速率范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了粘度的穩(wěn)定增加，同時(shí)所有組也表現(xiàn)出出色的剪切稀化行為（圖5A）。

通常，較高的粘度會(huì)導(dǎo)致較高的印刷保真度，這意味著 MC 可以用作增強(qiáng)水凝膠油墨粘度并提高其印刷保真度的補(bǔ)充劑。結(jié)果表明，開發(fā)的油墨在暴露于交替的高剪切應(yīng)力和低剪切應(yīng)力時(shí)具有恢復(fù)其彈性的能力，這意味著它們具有良好的形狀保持特性，適用于基于擠出的印刷。此外，還可以發(fā)現(xiàn)高壓滅菌對(duì)制備的油墨的流變學(xué)性能沒有不利影響，因此可以看作是一種方便有效的海藻酸鹽和甲基纖維素滅菌方法。

圖5 添加細(xì)胞懸液前后的油墨流變學(xué)特性

4. 基于蛋清支持油墨的復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)的可印刷性和構(gòu)建特性
通過手動(dòng)制作圓盤狀支架來評(píng)估EW支持的生物墨水的可擠出性及其形成穩(wěn)定鏈的能力。在所有組中均觀察到良好的可擠出性，并且可以形成連續(xù)長絲（根據(jù)其特定粘度和擠出行為調(diào)整印刷壓力）。作者從流變測(cè)量、燈絲塌陷（圖6A）和融合測(cè)試（圖6B）的結(jié)果得出結(jié)論，60-40(3-9) 和 HBSS(3-9) 墨水在 3D 支架制造中表現(xiàn)出出色的可印刷性和形狀保真度。作者進(jìn)一步探索了包含具有挑戰(zhàn)性的幾何特征的復(fù)雜體積結(jié)構(gòu)的3D打印，以研究這種新型電子戰(zhàn)墨水的自支撐能力（圖6C）。所有結(jié)構(gòu)都保持其形狀和設(shè)計(jì)特征，具有開放和相互連接的大孔，這對(duì)于細(xì)胞輸送氧氣和營養(yǎng)以及代謝副產(chǎn)物非常重要。此外，更復(fù)雜、體積更大的結(jié)構(gòu)具有更具挑戰(zhàn)性的特征（例如打印了解剖形狀、動(dòng)物模型和曲線交織多孔結(jié)構(gòu)）（圖6D-H）。

圖6 復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)的可印刷性和構(gòu)造特征

5. 3D打印AlgMC+EW支架的細(xì)胞相容性
為了評(píng)估3D打印AlgMC+EW墨水的接種hTERT-MSC的細(xì)胞活力和粘附行為，將支架培養(yǎng)1、4和7天，并對(duì)活/死細(xì)胞活力進(jìn)行染色。支架上活/死染色細(xì)胞的熒光圖像、細(xì)胞活力和粘附率的定量分析如圖7A-C所示。AlgMC+EW 支架中的細(xì)胞密度高于AlgMC組（圖7C），表明AlgMC+EW支架為MSC提供更具吸引力的環(huán)境。AlgMC+EW 支架上的細(xì)胞則相反，明顯擴(kuò)散并附著在支架表面（圖7A），這也導(dǎo)致粘附率增加（圖7C）。與此同時(shí)，幾乎所有的活細(xì)胞都顯示出足夠的粘附水平，它們散布在支架的表面并伸展以與相鄰的細(xì)胞連接，表現(xiàn)出絲狀偽足樣的延伸。此外，計(jì)算出的細(xì)胞粘附率進(jìn)一步增加，明顯高于AlgMC組（圖7C）。

圖7 無細(xì)胞AlgMC+EW支架的制備及3D打印支架的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

6. AlgMC+EW支架中人原代前成骨細(xì)胞(hOB)的成骨分化
為了進(jìn)一步研究 EW 對(duì)成骨分化的影響，將從骨關(guān)節(jié)炎患者的人股骨頭中分離出來的hOB懸浮在 AlgMC + EW 生物墨水中以制造載有 hOB 的支架；同時(shí)，載有hOB的普通 AlgMC 支架作為對(duì)照組進(jìn)行了生物打�。▓D8A）。AlgMC+EW墨水中的大部分hOB顯示出具有高細(xì)胞密度的細(xì)長形態(tài)，而在AlgMC支架中仍觀察到球形。此外，對(duì)支架中的細(xì)胞核和細(xì)胞骨架進(jìn)行熒光染色，以進(jìn)一步觀察第1、21和28天的細(xì)胞形態(tài)。而AlgMC支架中的細(xì)胞仍然小而圓，只有少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出輕微的細(xì)長細(xì)胞形態(tài)；類似的結(jié)果一直保持到第28天。此外，圖8D說明AlgMC+EW 支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于AlgMC。這些結(jié)果表明 EW 具有促進(jìn) hOB 細(xì)胞粘附、擴(kuò)散、遷移和增殖的功能（圖8）。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，這種效果甚至?xí)�增�?qiáng)，這可能是由于基于EW的生物墨水中存在蛋白質(zhì)，它為細(xì)胞附著提供了整合素結(jié)合基序。

圖8 3D支架的制備過程以及AlgMC和AlgMC+EW支架的細(xì)胞表征

綜上，本文開發(fā)了一種新型生物墨水，其優(yōu)化配方由海藻酸鹽、甲基纖維素和蛋清 (EW) 組成，它結(jié)合了良好的印刷適性和高形狀保真度以及良好的細(xì)胞反應(yīng)。為了研究添加EW對(duì)成骨分化的影響，在AlgMC+EW生物墨水中對(duì)人原代前成骨細(xì)胞(hOB)進(jìn)行了生物打印。它們顯示出hOB的高活力(93.7 ± 0.2 %) 和隨培養(yǎng)時(shí)間的粘附，以及生物墨水內(nèi)的增殖和遷移。與無 EW 支架相比，部分成骨標(biāo)記物（IBSP、BGLAP）的基因表達(dá)也得到了促進(jìn)。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb8dc