雙水相嵌入（生物）3D打印構(gòu)建無(wú)海藻酸、獨(dú)立、可灌注的超細(xì)和超薄壁管狀結(jié)構(gòu)

目前，生物工程纖維、血管在再生醫(yī)學(xué)和藥物篩選等應(yīng)用中的需求越來(lái)越大，但生物工程纖維、血管移植物的真正可用性仍然非常有限。近些年，3D生物打印技術(shù)為移植和再生提供了一種潛在的纖維、血管或血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，盡管在3D生物打印方面相對(duì)較大尺寸的纖維、類血管的制備取得了一定的成功，但具有超細(xì)直徑纖維或具有超薄壁的類血管結(jié)構(gòu)的制造仍然是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。最近，哈佛大學(xué)Y. Shrike Zhang教授課題組對(duì)這一重要問(wèn)題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，提出了一種利用雙水相嵌入3D生物打印策略打印纖維或管狀結(jié)構(gòu)。該策略采用高度生物可相容的生物水凝膠，利用互不相容的雙水相設(shè)計(jì)，打印過(guò)程中不再需要借助海藻酸鈉水性體系結(jié)構(gòu)，不僅如此，該體系允許生物墨水在不混溶的水性支撐浴中自由構(gòu)筑微纖維和管狀結(jié)構(gòu)。該打印策略具有極限制造能力，可以打印直徑為3 μm的固體纖維或直徑為40 μm、壁厚低至5 μm的管狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)進(jìn)一步接種內(nèi)皮細(xì)胞驗(yàn)證了該策略所構(gòu)建微血管結(jié)構(gòu)可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的有效載體，并驗(yàn)證了部分功能化和血管萌芽等。該策略將作為一個(gè)平臺(tái)，可以滿足未來(lái)不同類型的潛在生物醫(yī)學(xué)和其他應(yīng)用的需求，特別是與用于再生醫(yī)學(xué)和組織模型工程的超小直徑和超薄壁的管狀組織有關(guān)的應(yīng)用。

圖 1. 通過(guò)雙水相嵌入（生物）打印策略，打印無(wú)海藻酸、獨(dú)立、可灌注的超細(xì)和超薄壁管狀結(jié)構(gòu)打印過(guò)程示意圖。

研究者提出的雙水相水下嵌入打印策略結(jié)合了雙水相和同軸微流體生物打印技術(shù)，主要基于一種可光交聯(lián)的甲基丙烯�；�明膠（GelMA）作為水性生物墨水，以及聚氧化乙烯 （PEO）作為水性支持浴。在一定濃度下，GelMA和PEO在形成的雙水相系統(tǒng)中不相混溶，當(dāng)調(diào)整兩個(gè)水相的參數(shù)時(shí)，GelMA 生物墨水可以以嵌入的方式直接擠出到PEO支持浴中，打印形成穩(wěn)定的3D圖案。生物墨水不僅限于GelMA, 還包括透明質(zhì)酸等。

圖2. 優(yōu)化、調(diào)節(jié)打印參數(shù)，使打印纖維能獲得更大范圍的尺寸可調(diào)節(jié)性。

使用此生物打印策略，通過(guò)調(diào)節(jié)噴嘴直徑、墨水流量和打印噴頭移動(dòng)速度等打印參數(shù)，可以制備直徑在10-700 μm之間的GelMA固體纖維（圖2 A），這表明打印GelMA纖維具有簡(jiǎn)便性和強(qiáng)大的尺寸可調(diào)性。除了使用金屬針作為噴嘴外，研究者還采用了玻璃毛細(xì)管來(lái)打印超細(xì)纖維，通過(guò)毛細(xì)管打印能夠進(jìn)一步優(yōu)化GelMA纖維直徑范圍，可以制備從3 μm到60 μm的纖維（圖2 B），這有利于進(jìn)一步擴(kuò)展組織生物制造的應(yīng)用，因?yàn)橥ǔＧ闆r下，均質(zhì)水凝膠或顆粒狀水凝膠被用作水下擠出打印的支持浴時(shí)，由于機(jī)械阻力較高通常無(wú)法順利移動(dòng)和打印出超細(xì)的纖維，而利用研究者提出的打印策略，玻璃毛細(xì)管可以在PEO為主體的水溶液支持浴中順利移動(dòng)和打印（圖2 C-i）。此外，研究者展示了自制的、具有漸變尖端的超細(xì)玻璃毛細(xì)管也可以很容易地在PEO為主體的支持浴中從一側(cè)轉(zhuǎn)移到另一側(cè)（圖2 C-ii 上）。然而，在相同條件下，當(dāng)使用凝膠支持浴時(shí)，沿毛細(xì)管路徑的大量氣泡被引入凝膠浴系統(tǒng)（圖2 C-ii下)�？偟膩�(lái)講，雙水相嵌入打印策略克服了迄今為止水下生物打印的一個(gè)普遍挑戰(zhàn)。使用雙水相策略與機(jī)械擠壓方法相結(jié)合的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，它不僅允許重復(fù)修改打印圖案，在使用動(dòng)態(tài)配置的梯度濃度溶液作為支持浴時(shí)，還可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)形狀可重構(gòu)的四維（4D）打印。

圖3. 表面化學(xué)交聯(lián)誘導(dǎo)中空管狀纖維的形成。

此外，由于研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)在如上所述的PEO支持浴中直接打印GelMA纖維，他們?cè)O(shè)想通過(guò)表面交聯(lián)方法制備壁厚可調(diào)節(jié)的中空管狀纖維結(jié)構(gòu)�；�于此，研究者們創(chuàng)新性的提出采用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTG）作為表面化學(xué)交聯(lián)劑，通過(guò)四個(gè)步驟在PEO收集浴中生成管狀結(jié)構(gòu)（圖3 A）。通過(guò)控制MTG交聯(lián)時(shí)間，能夠精確地調(diào)整管狀結(jié)構(gòu)的壁厚從10 μm到100 μm不等，直至形成固體水凝膠纖維（圖3 B）。

圖4. 同軸打印基于GelMA的管狀結(jié)構(gòu)。

傳統(tǒng)同軸濕紡已被廣泛用于高通量制備中空管狀結(jié)構(gòu)，基于此，同軸微流體生物打印方法也可以實(shí)現(xiàn)灌注管狀結(jié)構(gòu)圖案的3D打印，正如研究者先前所報(bào)道的部分工作（Advanced Materials, 2018, 30, 1706913；Science Advances, 2022, 8, eabq6900）。然而，同軸擠壓策略有兩個(gè)關(guān)鍵限制。首先，它通常需要在海藻酸鈉的存在下進(jìn)行，海藻酸鈉是一種可以通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2+）物理交聯(lián)的生物材料，以確保擠出過(guò)程中的快速成型。因此，海藻酸鈉必須單獨(dú)或混合作為生物墨水中的一種成分。一般情況下，除非經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或制備后犧牲掉，否則海藻酸鈉會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)和伸展。盡管研究者最近證明，通過(guò)將明膠復(fù)合生物墨水?dāng)D出到冰水支持浴中可以制備不包括海藻酸鈉的管狀結(jié)構(gòu)（ACS Biomaterials Science & Engineering, 2019, 5, 5514），但這無(wú)法解決第二個(gè)挑戰(zhàn)。通常，同軸擠出的管狀纖維的直徑和壁厚保持在相對(duì)較大的尺寸上，所制備管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑無(wú)法輕易低于100 μm，壁厚最小為幾十微米。即使研究者在之前的工作中提出了收縮打印法將內(nèi)徑減小到低于50 μm（Nature Communications, 2020, 11, 1267），但管壁厚度還是無(wú)法低于50 μm。毫無(wú)疑問(wèn)，進(jìn)一步減小管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)徑和控制壁厚小于50 μm仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。為此，研究人員通過(guò)利用所提出的雙水相嵌入同軸打印策略，證明了極大范圍地調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)直徑和壁厚的可行性。研究者使用自制的雙層同軸噴嘴，其中GelMA從殼層輸送，而PEO從芯層共同輸送到水性PEO支撐浴中，最終使用光交聯(lián)固化后形成GelMA水凝膠管狀結(jié)構(gòu)（圖4 A）。進(jìn)一步，可以輕易地通過(guò)改變水凝膠的流量、打印噴頭的移動(dòng)速度等來(lái)調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)直徑和壁厚。研究表明，使用該同軸噴嘴可以獲得傳統(tǒng)的同軸濕法或生物打印設(shè)備中不可能實(shí)現(xiàn)的管狀結(jié)構(gòu)尺寸，例如內(nèi)徑最小可達(dá)37 μm、而壁厚最小可達(dá)4 μm（圖4 B-E）。此外，為了說(shuō)明超薄管壁的實(shí)際應(yīng)用，研究者制備了不同壁厚的管狀結(jié)構(gòu)。使用自制的灌流裝置分析了攜氧紅細(xì)胞在管狀結(jié)構(gòu)中氧氣的擴(kuò)散情況，結(jié)果表明，具有超薄壁特征的管狀結(jié)構(gòu)可以加速氧氣的擴(kuò)散，這也將適用于其他生物分子。這顯示出了雙水相水下嵌入同軸打印策略比傳統(tǒng)同軸法打印的壁厚更能模擬毛細(xì)血管或小血管的物質(zhì)傳輸。同時(shí)，研究者也進(jìn)一步打印了由管狀纖維組成的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)（圖4 F），這表明該打印策略能夠完成復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)的打印，利用該方法研究人員也成功打印了血管化的腫瘤組織模型。

圖5. 同軸打印的管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞行為。

研究者隨后開始評(píng)估雙水相水下嵌入打印策略的細(xì)胞相容性。研究者設(shè)計(jì)了一種微流控芯片裝置，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）接種到管腔內(nèi)。細(xì)胞在接種后逐漸從圓形開始伸展，最后形成紡錘形（圖5 A）。培養(yǎng)7天后，細(xì)胞活力高達(dá)98%（圖5 A，圖5 B-i）。在7天的培養(yǎng)過(guò)程中，HUVECs保持了很強(qiáng)的代謝活性，細(xì)胞鋪展面積逐漸增加（圖5 B-ii 和 iii）。 通過(guò)肌動(dòng)蛋白染色，可以觀察到培養(yǎng)第1天，細(xì)胞分布均勻，貼壁緊密，細(xì)胞生長(zhǎng)和重組明顯，在第7天后形成覆蓋整個(gè)管腔內(nèi)表面的致密單層結(jié)構(gòu)（圖5 C和D）。并且，在培養(yǎng)期間，內(nèi)皮細(xì)胞在管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)表達(dá)出了明顯的人緊密連接蛋白1（ZO-1，圖5 E）。研究人員為了證明無(wú)海藻酸鈉引入的優(yōu)勢(shì)，利用GelMA管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了萌芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明與基于藻酸鈉的管狀結(jié)構(gòu)不同，只有GelMA組成的管狀結(jié)構(gòu)很容易地被內(nèi)皮細(xì)胞重塑、形成萌芽和多尺度血管化。這些結(jié)果表明，雙水相水下嵌入打印策略制備的工程血管具有很好的細(xì)胞相容性，有利于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展、功能化和多尺度血管化的實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員分別使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟近曲小管上皮細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖6. 同軸打印的管狀組織的寬尺寸可調(diào)整性。

具有大范圍可調(diào)節(jié)的工程血管是成功復(fù)制血管結(jié)構(gòu)和功能以用于轉(zhuǎn)化應(yīng)用的重要一步。傳統(tǒng)的同軸微流體生物打印通常不允許形成具有超細(xì)直徑或超薄壁的血管導(dǎo)管。研究者成功地在管狀結(jié)構(gòu)（直徑從40到2000 μm，相應(yīng)的壁厚從5到500 μm）的內(nèi)腔表面接種了內(nèi)皮細(xì)胞（圖6），初步證明雙水相水下嵌入（生物）打印策略具有靈活性，可以實(shí)現(xiàn)制備大范圍、可調(diào)節(jié)的類血管結(jié)構(gòu)。該打印策略打印的管狀組織尺寸接近或完全覆蓋人體血管尺寸，為滿足不同類型應(yīng)用的需求提供了可能性，特別是對(duì)于具有非常小直徑和壁厚的血管尺寸的應(yīng)用。

以上相關(guān)成果以 “Liquid-Embedded (Bio)printing of Alginate-Free, Standalone, Ultra-Fine, and Ultra-Thin-Walled Cannular Structures” 為題發(fā)表在《PNAS》上。文章通訊作者為Y. Shrike Zhang教授。文章第一作者為唐國(guó)勝（Guosheng Tang）教授，哈佛大學(xué)聯(lián)培博士、博士后。論文共同第一作者為哈佛醫(yī)學(xué)院Dr. Zeyu Luo、Dr. Liming Lian，其它作者還包括哈佛醫(yī)學(xué)院Dr. Jie Guo、Dr. Sushila Maharjan、Carlos Ezio Garciamendez-Mijares、Prof. Mian Wang、Prof. Wanlu Li、Zhenrui Zhang、Dr. Di Wang、Prof. Maobin Xie、Prof. Hossein Ravanbakhsh、Dr. Cuiping Zhou、Dr. Xiao Kuang 和廣州醫(yī)科大學(xué)Dr. Yingying Hou、Prof. Xiyong Yu等。

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https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2206762120