3D打印表面活化鎂離子的多孔聚醚醚酮支架

來(lái)源：EngineeringForLife

由于天然骨源的短缺，陶瓷、金屬、聚合物和其他人工骨移植材料都在臨床上得到廣泛應(yīng)用。聚醚醚酮憑借其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、較高結(jié)構(gòu)強(qiáng)度且符合骨骼力學(xué)性能等特點(diǎn)，成為骨科植入物的優(yōu)秀材料，但其具有加工困難，高生物惰性等缺點(diǎn)，限制了該材料的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。如何提高聚醚醚酮植入材料生物安全性、生物相容性、成骨效應(yīng)和其他生物活性是進(jìn)一步擴(kuò)展該材料應(yīng)用的重要突破點(diǎn)。

近期，第四軍醫(yī)大學(xué)的郭征、李小康聯(lián)合北京大學(xué)的鄭玉鋒通過(guò)3D打印技術(shù)，在鎂金屬表面構(gòu)建了多孔的聚醚醚酮（PEEK）支架，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證了該材料的促血管生成和成骨能力。相關(guān)論文“Magnesium surface-activated 3D printed porous PEEK scaffolds for in vivo osseointegration by promoting angiogenesis and osteogenesis”發(fā)表在Bioactive Materials雜志上。

1. 文章總體思路
通過(guò)熔融成型沉積技術(shù)制備了3D打印多孔PEEK植入物，對(duì)其表面沉積聚多巴胺（PDA）涂層，并利用PDA螯合具有生物活性的鎂離子。作者設(shè)計(jì)了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：純PEEK支架（PP）、PDA表面修飾PEEK支架（PPD）、PDA-Mg2+表面修飾PEEK支架（PPDM），并在各實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)MC3T3-E1和HUVECs評(píng)估多孔PEEK支架的生物毒性、成骨和促血管生成能力。通過(guò)將支架植入兔的股骨髁，評(píng)估材料對(duì)體內(nèi)骨缺損修復(fù)過(guò)程中的骨整合能力和生物活性（圖1）。

圖1 表面活化鎂離子多孔 PEEK 支架的促血管生成和成骨作用

2. 多孔PEEK支架的3D打印技術(shù)研究
作者對(duì)3D打印得到的支架材料進(jìn)行了孔隙率、孔徑、孔隙聯(lián)通性、應(yīng)力應(yīng)變、壓縮模量等力學(xué)測(cè)試，證明其力學(xué)性能與松質(zhì)骨相似（圖2）。接著通過(guò)掃描電鏡、原子力顯微鏡和水接觸角測(cè)試，發(fā)現(xiàn)各組支架表面形態(tài)沒(méi)有顯著差異，且PDA改性后支架親水性明顯提升。Mg2+釋放實(shí)驗(yàn)證明該支架可在兩周內(nèi)持續(xù)釋放生物活性金屬離子。

圖2 多孔PEEK支架的表征和表面分析

3. 多孔PKKE支架的生物安全性和生物活性研究
其次，進(jìn)行了材料的生物安全性和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)（圖3-5）。通過(guò)對(duì)MC3T3-E1和HUVECs進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDA及PDA-Mg2+改性后支架可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且各組凋亡水平無(wú)明顯差異，證明該材料無(wú)生物毒性。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)電鏡、纖維狀肌動(dòng)蛋白和黏著斑蛋白的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1和HUVECs細(xì)胞在改性后表面形態(tài)與未改性材料相比，鋪展面積及黏附相關(guān)蛋白表達(dá)含量增加。該組實(shí)驗(yàn)證明Mg2+和PDA表面修飾不會(huì)抑制細(xì)胞增殖或增加細(xì)胞凋亡率，并能夠提高細(xì)胞在PEEK材料表面的粘附性，Mg2+可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞和HUVECs的增殖，增加MC3T3-E1和HUVECs中vinculin蛋白的表達(dá)。

圖3 與各多孔PEEK支架共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和凋亡情況

圖4 多孔PEEK支架表面細(xì)胞的粘附情況

圖5 通過(guò)間接接觸與支架共培養(yǎng)的 HUVECs 和 MC3T3-E1 細(xì)胞的粘附情況

4. 多孔PEEK支架的體外成骨效果研究
再次，進(jìn)行了支架的MC3T3-E1成骨分化實(shí)驗(yàn)（圖6）。首先在轉(zhuǎn)錄水平中，直接接觸共培養(yǎng)后PPDM和PPD組Runx2、Col1和Alp基因的表達(dá)顯著上調(diào)，而間接接觸共培養(yǎng)PPDM組中的Runx2、Col1、Alp和Opn基因與其他兩組相比上調(diào)。其次灰度分析表明，各培養(yǎng)狀態(tài)下PPDM中COL1、OPN、Osterix和RUNX2的相對(duì)蛋白表達(dá)水平均高于其余兩組。最后，在堿性磷酸酶和茜素紅染色中發(fā)現(xiàn)PPDM組中ALP表達(dá)與礦化結(jié)節(jié)含量均高于其余兩組。自此，作者從成骨細(xì)胞在骨形成中的三個(gè)主要階段（成骨細(xì)胞的黏附和增殖、成骨分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化）多角度證明了該材料具有促進(jìn)細(xì)胞成骨分化和成骨細(xì)胞礦化的作用。

圖6 不同支架對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化和礦化的影響

5. 改性PEEK支架的體外促血管生成效果研究
然后進(jìn)行了HUVECs的遷移和血管生成實(shí)驗(yàn)（圖7）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及血管形成實(shí)驗(yàn)證明PPDM組與其余樣品相比具有促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成的功能。蛋白水平實(shí)驗(yàn)中，對(duì)血管標(biāo)記CD31和EMCN進(jìn)行Western blotting及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PPDM相關(guān)蛋白表達(dá)含量顯著高于其余樣品。證明PPDM有助于血管生成。

圖7 不同支架對(duì) HUVECs 遷移和血管生成的影響

6. 改性PEEK支架的體內(nèi)促血管生成研究
最后驗(yàn)證了PPDM支架在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的成骨和促血管生成的作用（圖8）。從血管生成角度來(lái)講，micro-CT顯示PPDM支架內(nèi)部血管更為成熟和連續(xù)，且PPDM組BVV/TV、血管直徑和血管密度都高于其余樣品。在硬組織切片中血管密度和血管直徑測(cè)量中，也觀察到類似情況，但植入8周后PPDM與PPD組血管密度差異不顯著。

圖8 多孔PEEK支架中的體內(nèi)血管向內(nèi)生長(zhǎng)情況

7. 改性PEEK支架的體內(nèi)骨生成研究
從體內(nèi)骨整合實(shí)驗(yàn)角度分析（圖9），多孔PEEK支架內(nèi)骨向內(nèi)生長(zhǎng)的3D重建結(jié)果顯示，植入早期（4周）PPDM組骨體積分?jǐn)?shù)顯著高于其余各組，12周后PPD與PPDM顯著高于PP組；骨小梁厚度雖然在植入早期三組無(wú)明顯差別，但12周后PPDM組顯著高于其余各組。硬組織切片中顯示在所有時(shí)間點(diǎn)，PPD組和PPDM組的骨組織與植入物接觸始終高于PP組。結(jié)合PPDM組支架中的Mg2+釋放曲線和體外促血管生成作用可以得出結(jié)論，PPDM組支架能夠通過(guò)在植入后早期釋放鎂離子來(lái)促進(jìn)多孔PEEK支架內(nèi)的血管生長(zhǎng)。

圖9 各組多孔PEEK支架的體內(nèi)骨整合情況

綜上，作者證明3D打印多孔PEEK結(jié)構(gòu)并在其表面構(gòu)建PDA-Mg2+生物活性涂層是一種提高生物惰性材料生物相容性的簡(jiǎn)便方法。含鎂生物活性涂層改性的多孔聚醚醚酮支架在體外表現(xiàn)出優(yōu)異的生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞增殖和粘附、成骨分化和血管形成。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PDA涂層顯著改善了多孔PEEK支架的界面骨結(jié)合能力，而鎂離子通過(guò)促進(jìn)早期血管向內(nèi)生長(zhǎng)而增強(qiáng)了多孔PEEK支架內(nèi)的骨向內(nèi)生長(zhǎng)能力（圖10）。該方法為PEEK材料的臨床應(yīng)用提供了新的方法。

圖10 鎂表面活化的 3D 打印多孔PEEK支架促進(jìn)血管生成和成骨的機(jī)制

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.05.011