《Advanced Science》：生物3D打印功能化氣管重建

來(lái)源： EngineeringForLife
本論文第一作者：霍瑩瑩、徐勇、吳曉娣；
通訊作者：華宇杰、Y. Shrike Zhang、周廣東。該工作材料學(xué)部分得到了上海交大朱麟勇教授團(tuán)隊(duì)的大力支持。

功能化氣管重建一直是臨床上面臨的重大挑戰(zhàn)，其關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)在于缺乏理想的氣管移植物。組織工程技術(shù)為構(gòu)建功能化氣管移植物提供了一種可行的策略。目前，利用組織工程管狀軟骨實(shí)現(xiàn)的氣管再生已初步得到驗(yàn)證，但是管狀氣管軟骨結(jié)構(gòu)不可避免會(huì)造成運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的局部機(jī)械應(yīng)力集中，同時(shí)也缺乏構(gòu)建分布在軟骨結(jié)構(gòu)之間的血管化纖維結(jié)締組織和管腔內(nèi)壁上皮組織。眾所周知，天然氣管是具有交替分布的軟骨環(huán)（C環(huán)）和血管化纖維環(huán)（VF環(huán)），以及氣道內(nèi)壁上皮化構(gòu)成的管狀異質(zhì)組織結(jié)構(gòu)，這種異質(zhì)組織結(jié)構(gòu)對(duì)于實(shí)現(xiàn)氣管的力學(xué)和生理功能重建至關(guān)重要。

近期，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院、上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、組織工程國(guó)家工程研究中心周廣東團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合哈佛醫(yī)學(xué)院Y. Shrike Zhang教授，設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種組織特異性光交聯(lián)生物墨水，并應(yīng)用生物3D打印技術(shù)構(gòu)建軟骨-血管化纖維組織交替結(jié)構(gòu)的仿生氣管（CVFIT）。如圖1所示，C環(huán)和VF環(huán)交替設(shè)計(jì)的管狀結(jié)構(gòu)可以精準(zhǔn)模擬天然氣管的生理結(jié)構(gòu)與功能。其中，C環(huán)是由軟骨細(xì)胞負(fù)載的軟骨特異性光交聯(lián)生物墨水（p-CB）構(gòu)成；VF環(huán)是由成纖維細(xì)胞負(fù)載的纖維組織特異性光交聯(lián)生物墨水（p-VFB）構(gòu)成；并通過(guò)酰胺化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)C環(huán)與VF環(huán)之間的一體化化學(xué)鍵鍵合。生物3D打印的CVFIT不僅能夠在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)軟骨-血管化纖維組織一體化的氣管再生，而且能夠?qū)崿F(xiàn)節(jié)段性氣管缺損修復(fù)。相關(guān)研究論文：“Functional Trachea Reconstruction Using 3D-Bioprinted Native-like Tissue Architecture Based on Designable Tissue-specific Bioinks”發(fā)表于Advanced Science上。

圖1 組織特異性生物墨水構(gòu)建及功能化氣管重建示意圖

1. 組織特異性生物墨水制備與表征
為了構(gòu)建適合軟骨和纖維組織再生的生物墨水，研究者選擇軟骨組織來(lái)源的脫細(xì)胞細(xì)基質(zhì)制備光交聯(lián)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（ACMMA）水凝膠，并添加甲基丙烯�；髂z（GelMA）和甲基丙烯�；蛩彳浌撬兀–SMA）構(gòu)成軟骨特異性光交聯(lián)生物墨水；選擇真皮組織來(lái)源的脫細(xì)胞細(xì)基質(zhì)制備光交聯(lián)真皮脫細(xì)胞基質(zhì)（ADMMA）水凝膠，并添加甲基丙烯�；该髻|(zhì)酸（HAMA）和八臂琥珀酸酯化聚乙二醇（8-PEG-NHS）構(gòu)成血管化纖維組織特異性光交聯(lián)生物墨水。兩種組織特異性光交聯(lián)生物墨水均可通過(guò)光引發(fā)自由基聚合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)快速交聯(lián)和有效增強(qiáng)力學(xué)強(qiáng)度，而8-PEG-NHS介導(dǎo)的兩相界面酰胺化反應(yīng)能夠顯著加強(qiáng)相鄰環(huán)之間的界面整合。熒光染色和原子力顯微鏡（AFM）圖像證實(shí)了界面的無(wú)縫融合；X射線光電子能譜（XPS）證實(shí)了基于酰胺化反應(yīng)的界面化學(xué)鍵整合。進(jìn)一步，力學(xué)有限元分析結(jié)果顯示，軟-硬交替管狀結(jié)構(gòu)具有縱向拉伸性和側(cè)向彎曲能力，而單一硬度管狀結(jié)構(gòu)在側(cè)向彎曲時(shí)會(huì)導(dǎo)致局部區(qū)域機(jī)械應(yīng)力集中，同時(shí)也缺乏縱向拉伸性（如圖2所示）。

圖2 組織特異性生物墨水及界面整合表征

2. 仿生氣管打印構(gòu)建與表征
首先，研究者證實(shí)溫敏性p-CB生物墨水和高粘度p-VFB生物墨水是兩種擠出式生物3D打印的可行策略。接著，研究者利用p-CB和p-VFB生物墨水，通過(guò)雙噴頭生物3D打印技術(shù)，構(gòu)建出具有交替管狀結(jié)構(gòu)的氣管類似物，然后在紫外（365 nm, 20 mW/cm²）光照下進(jìn)行交聯(lián)成型，以增強(qiáng)力學(xué)強(qiáng)度并維持三維形態(tài)。在多細(xì)胞生物3D打印中，熒光標(biāo)記的軟骨細(xì)胞（綠色）和成纖維細(xì)胞（紅色）呈現(xiàn)交替分布于管狀結(jié)構(gòu)中，從而證實(shí)結(jié)合組織特異性生物墨水的生物3D打印技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)多種細(xì)胞的精準(zhǔn)定位和異質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)建。（如圖3所示）

圖3 生物墨水可打印性評(píng)價(jià)和生物3D打印仿生氣管表征

3. 體內(nèi)氣管再生與功能評(píng)價(jià)
研究者將生物3D打印CVFIT植入裸鼠皮下，并系統(tǒng)進(jìn)行了大體觀、力學(xué)性能、組織學(xué)染色、定量檢測(cè)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皮下植入8周后，實(shí)驗(yàn)組CVFIT成功再生了軟骨-血管化纖維組織交替結(jié)構(gòu)的仿生氣管，而對(duì)照組僅為單一軟骨管狀結(jié)構(gòu)。由于軟-硬交替分布的組織結(jié)構(gòu)，再生的仿生氣管表現(xiàn)出優(yōu)異的抗壓性、縱向拉伸性和側(cè)向彎曲能力；而再生的軟骨管，由于再生軟骨僅僅呈現(xiàn)單一硬度結(jié)構(gòu)，使得缺乏縱向拉伸性，在側(cè)向應(yīng)力加載下存在明顯的結(jié)構(gòu)缺陷，這不可避免會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)（如抬頭、低頭、頸部側(cè)向彎曲等）過(guò)程中氣管通氣順暢產(chǎn)生不利影響。組織學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，再生的仿生氣管呈現(xiàn)與天然氣管類似的軟骨-血管化纖維組織交替結(jié)構(gòu)以及組織特異性ECM沉積，這一仿生結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)保證了軟骨環(huán)可以從鄰近的血管化纖維環(huán)中獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)�？傊�-硬交替組織結(jié)構(gòu)的再生氣管不僅有利于力學(xué)功能重建（抗壓、拉伸和彎曲能力），而且有利于氣管生理學(xué)功能重建。（如圖4所示）

圖4 體內(nèi)氣管再生與功能重建評(píng)價(jià)

4. 節(jié)段性氣管缺損修復(fù)評(píng)價(jià)
為了進(jìn)一步驗(yàn)證仿生氣管實(shí)現(xiàn)原位功能重建的可行性，研究者首先將生物3D打印的CVFIT經(jīng)體內(nèi)皮下植入預(yù)培養(yǎng)8周，然后將再生氣管連同血管蒂進(jìn)行端到端吻合術(shù)，修復(fù)兔節(jié)段性氣管缺損（15 mm長(zhǎng)）。術(shù)后8周，再生氣管呈現(xiàn)完整連續(xù)的管腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)表面光滑，無(wú)痰液堆積，并且與天然氣管實(shí)現(xiàn)一體化整合。組織學(xué)結(jié)果表明，生物3D打印的仿生氣管可以實(shí)現(xiàn)與天然氣管類似的軟骨-血管化纖維交替結(jié)構(gòu)的組織再生和上皮化功能重建。（如圖5所示）

圖5 節(jié)段性氣管缺損重建修復(fù)評(píng)價(jià)

文章來(lái)源：
http://doi.org/10.1002/advs.202202181