誘導(dǎo)自然骨生成，用于3D打印的促成骨互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水

來源：EngineeringForLife

生物打印是一種新興的增材制造方法，用于制備再生醫(yī)學(xué)的3D結(jié)構(gòu)。然而，開發(fā)具有高打印性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物降解性和生物活性特性的細胞相容生物墨水仍然是將3D生物打印技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床前和臨床模型的主要挑戰(zhàn)。

來自Texas A&M University的Akhilesh K. Gaharwar團隊開發(fā)了一種納米工程離子-共價糾纏(NICE)的互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水配方，用于3D骨生物打印。通過一系列實驗證實了NICE生物墨水在制造患者特異性、可植入的3D支架用于修復(fù)顱頜面骨缺損的能力。該生物墨水有望推動3D打印再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。相關(guān)論文“NanoengineeredOsteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue”發(fā)表在ACS Applied Materials ＆ Interfaces雜志上。

NICE生物墨水有三個主要成分：共價交聯(lián)的甲基丙烯酰明膠(GelMA)，離子交聯(lián)的卡帕卡拉膠(kCA)，和靜電帶電的納米硅酸鹽(nSi)。GelMA提供了一種類似細胞外基質(zhì)(ECM)的環(huán)境。kCA是從海提取的多糖，可以通藻中過鉀離子進行離子交聯(lián)(圖1A)。GelMA和kCA的結(jié)合形成了離子共價糾纏網(wǎng)絡(luò)(圖1A)。這種結(jié)合極大地提高了水凝膠的機械強度和韌性。

為了評估生物墨水的可打印性，研究者選擇了一個能夠打印的高長寬比結(jié)構(gòu)，從而找到一系列可打印的成分(圖1B-C)。結(jié)果表明，如果沒有足夠的kCA,GelMA和nSi打印效果不好，因為它們在熱凝膠前會流動(圖1D)。kCA提供臨界粘度和屈服應(yīng)力，在擠壓層冷卻并通過熱凝膠固化時，將其固定在適當位置。

圖1 NICE生物墨水設(shè)計和打印性能評估

接下來研究者設(shè)計了峰保持流變性試驗來模擬3D打印過程中的生物墨水環(huán)境。交聯(lián)的3D打印水凝膠能夠維持剪切、彎曲和拉伸等機械變形，沒有明顯的永久變形，并能迅速恢復(fù)其原始形狀(圖2B)。將支架交聯(lián)并植入下頜骨的熱塑性模型中發(fā)現(xiàn)，NICE生物墨水能夠迅速將表面粘在一起，抵抗剪切和分層力（圖2 D）。根據(jù)這些結(jié)果，最終選擇7.5% GelMA、2%nSi和1%kCA作為優(yōu)化的生物墨水進行進一步測試。

圖2 NICE生物墨水的流變性和3D打印結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能

3D生物打印支架最初是透明的，但培養(yǎng)60天后，支架變得不透明(圖3A)。力學(xué)測試顯示，3D打印支架在PBS和培養(yǎng)基的作用下，其壓縮模量和韌性在14天內(nèi)保持不變，但在第21天出現(xiàn)顯著損失(圖3B)。支架在60天內(nèi)保持了結(jié)構(gòu)的完整性，并保留了超過80%的初始質(zhì)量(圖3C)。掃描電鏡成像顯示，從第14天開始微觀結(jié)構(gòu)密度增加(圖3D)。這表明，發(fā)生了大量的細胞介導(dǎo)的重塑，其廣度足以將3D打印支架的宏觀結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起。

圖3 NICE支架支持細胞誘導(dǎo)的基質(zhì)重塑

然后研究者使用組織學(xué)方法評估了幾個月以來由hMSCs對NICE生物打印支架的重塑，顯示軟骨形成的軟骨內(nèi)骨化樣重塑過程，隨后礦化，類似于自然骨形成。結(jié)果表明，NICE生物墨水即使在沒有成骨誘導(dǎo)因子的情況下也能誘導(dǎo)成骨分化和組織重塑。此外，在這幾個月的培養(yǎng)和重塑過程中，支架保持其整體形狀和完整性，這表明支架的生物降解與細胞重塑是同步的。（圖 4）

圖4 3D生物打印支架的ECM重塑

研究者用Von Kossa和茜素紅染色來區(qū)分類骨質(zhì)和實際鈣化骨(圖5A)。正如預(yù)期的那樣，VonKossa和茜素紅在早期的時間點上都沒有顯著的鈣或磷酸鹽存在，但幾周后，可以看到顯著的鈣和磷酸鹽沉積。使用鈣-甲酚酞絡(luò)合酮測定法定量檢測鈣含量并且通過EDS顯示鈣含量的變化(圖5B-D)。結(jié)果顯示，支架內(nèi)最初并沒有鈣的存在，培養(yǎng)60天后，由于hMSCs成骨分化，鈣和磷酸鹽含量增加。

圖5 3D生物打印支架的礦化基質(zhì)

為了證實軟骨內(nèi)成骨，研究者使用RNA全轉(zhuǎn)錄組測序來表征hMSCs中的基因表達。通過對暴露于nSi的hMSCs的全轉(zhuǎn)錄組測序，可以確定軟骨內(nèi)骨形成的基因表達增加。值得注意的是，BMP和TGF信號同時存在，它們的SMAD信號通路表達增加，表明NICE能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨內(nèi)分化。（圖 6）

圖6 nSi對hMSC基因表達的影響

綜上所述，這種NICE生物墨水具有3D生物打印骨組織的多種理想特性，包括高打印性能、酶降解性和骨誘導(dǎo)性。這項研究的最終目標是為患者打印特定的骨支架來精確匹配他們的損傷。這種技術(shù)將作為一種可定制的、易于操作的自體骨移植替代方案，為外科醫(yī)生提供更多的骨手術(shù)選擇。

參考閱讀：

David Chimene, Logan Miller, Lauren M.Cross, Manish K. Jaiswal, Irtisha Singh, and Akhilesh K. Gaharwar.Nanoengineered Osteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue. ACSApplied Materials & Interfaces.

https://doi.org/10.1021/acsami.9b19037