阿卜杜拉國王科技大學開發(fā)3D打印SRS顯微鏡

來源：江蘇激光聯盟

近年來，微型顯微鏡的出現可為活細胞進行無標記成像，而以往許多生物成像技術需要將熒光染料添加到特定的細胞目標中。來自阿卜杜拉國王科技大學的研究人員從細長的燈塔透鏡設計中汲取了靈感，開發(fā)了高NA 3D打印顯微鏡，可以更容易觀察皮氏培養(yǎng)皿，并觀察包括癌細胞生長在內的生物過程的分子水平細節(jié)。

▲圖形摘要

受激拉曼散射(SRS)顯微成像是一種無標記的化學成像技術，在生物學和醫(yī)學中具有引人注目的應用，其中包括單細胞代謝、神經科學和組織組織學。憑借其固有的光學切片能力，SRS顯微成像技術可以繪制樣品中化學鍵的三維分布，其靈敏度允許對生物樣品進行視頻速率成像。受激拉曼散射Stimulated Raman Scattering (SRS)是1962年伍德伯里（Woodburry）和恩戈（Ng）偶然發(fā)現的。高強度的激光和物質分子發(fā)生強烈的相互作用，使散射過程具有受激發(fā)射的性質,這種散射光是拉曼散射光，所以這一種非線性光學效應稱受激拉曼散射。受激拉曼散射表現出閾值特性，像激光器一樣只有適當的泵功率才能產生。當分子振動由不同波長的兩個激光束相干地驅動時，會發(fā)生SRS，這兩個激光束在空間和時間上重疊，并且它們的光頻率差異對應于分子的振動模式。在這種情況下，被驅動的相干分子振動會在兩個光束之間傳遞能量，短波長的光束（泵浦光束）會發(fā)生強度損失（受激拉曼損耗），而長波長的光束（斯托克斯束））經歷強度增加（刺激拉曼增益，SRG）。

但是，SRS顯微成像的一個缺點是檢測系統受到背景信號的影響，該背景信號稱為交叉相位調制(cross‐phase modulation,XPM)，它是一種普遍存在的非線性現象，該信號是由激光脈沖與樣品之間的強烈相互作用產生的，會產生虛假的背景信號，從而使SRS測量中的高對比度成像變得困難。為了避免SRS顯微鏡中與XPM相關的背景信號影響，需要使用能夠收集廣角光的笨重的玻璃物鏡，它們通常具有毫米以下的工作距離，因此，這類鏡頭幾乎不可能安裝在用于培養(yǎng)活細胞進行生物成像的臺式培養(yǎng)箱中。

在這里，研究人員介紹了一個高NA 3D打印聚光鏡，該聚光鏡可安裝在臺式培養(yǎng)箱中，并有效地將原本高度發(fā)散的光束引導到光電探測器。該透鏡具有折反射設計，也就是說，它是由折射和反射光學元件制成的，以實現較高NA。折射元件在透鏡的中心，收集光束的低發(fā)散部分，而反射元件在透鏡的外部，收集光束的高發(fā)散部分。通過使用此透鏡，研究人員可以在臺式培養(yǎng)箱中測量不含XPM的SRS光譜。根據研究結果，這種3D打印顯微鏡頭可以代替體積龐大且昂貴的高NA顯微鏡物鏡，用于點掃描顯微鏡中的前向信號采集。

該高NA 3D打印SRS顯微鏡通過使用激光脈沖從生物樣本中收集分子振動信號。并且SRS顯微鏡能夠以實時速度生成高分辨率，無創(chuàng)圖像的能力促使研究人員也將其部署到體內疾病診斷研究中。

▲3D打印鏡頭的圖像（頂部）。印刷在玻璃基板上的鏡頭3D的光學圖像（顯微鏡蓋玻片#1,5）（底部）。鏡片中央部分的SEM圖像，顯示菲涅耳狀的中央折射部分和外部反射部分

在校準試驗證實他們的新透鏡可以拒絕交叉相位調制背景后，研究人員將目光投向了在傳統培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的人類癌細胞。這些實驗表明，這種透鏡可以以類似于傳統SRS顯微鏡的分辨率對細胞內部組件進行成像，但方式更加方便，成本也更低。

帶有不同采集光學元件的受激拉曼散射（SRS）成像。

▲圖解：A，非諧振波數（2550 cm -1）的IP‐S 3D打印網格的SRS圖像。0.4 NA鏡頭可看到與交叉相位調制（XPM）相關的強烈背景，而3D打印鏡頭和高NA顯微鏡物鏡則可抑制這種情況。B，SRS圖像在2950cm -1波數處，其中光聚合物拉曼光譜具有峰值。C，HepG2癌細胞在2850 cm -1的SRS圖像，突出顯示了細胞中的脂質滴。用3D打印透鏡抑制XPM偽像可與高NA顯微鏡物鏡相媲美。用1.27 NA顯微鏡物鏡激發(fā)

本文一作Bertoncini表示，通常用來收集SRS顯微鏡信號的物鏡要花費數千美元，現在我們有一個具有類似功能的鏡頭而且這個價格用不到之前的十分之一來生產。

本文來源：Andrea Bertoncini et al, 3D ‐Printed high‐NA catadioptric thin lens for suppression of XPM background in Stimulated Raman Scattering microscopy, Journal of Biophotonics(2020). DOI: 10.1002/jbio.202000219